Aplicación de AlDeSense para estratificar células de cáncer de ovario basadas en la actividad de aldehído deshidrogenasa 1A1
Summary
Los métodos para medir la actividad de ALDH1A1 en células vivas son críticos en la investigación del cáncer debido a su estado como biomarcador de tallo. En este estudio, empleamos una sonda fluorogénica selectiva de isoformas para determinar los niveles relativos de actividad de ALDH1A1 en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario.
Abstract
La recaída después del tratamiento del cáncer a menudo se atribuye a la persistencia de una subpoblación de células tumorales conocidas como células madre cancerosas (CSC), que se caracterizan por su notable capacidad de iniciación y autorenovación tumoral. Dependiendo del origen del tumor (por ejemplo, ovarios), el perfil de biomarcadores de superficie de CSC puede variar drásticamente, lo que hace que la identificación de tales células a través de la tinción inmunohistoquímica sea un esfuerzo difícil. Por el contrario, la aldehído deshidrogenasa 1A1 (ALDH1A1) se ha convertido en un excelente marcador para identificar las CSC, debido a su perfil de expresión conservado en casi todas las células progenitoras, incluidas las CSC. La isoforma ALDH1A1 pertenece a una superfamilia de 19 enzimas que son responsables de la oxidación de varios aldehídos endógenos y xenobióticos a los productos de ácido carboxílico correspondientes. Chan et al. desarrollaron recientemente AlDeSense, una sonda de “encendido” selectiva de isoformas para la detección de la actividad de ALDH1A1, así como un reactivo de control de coincidencia no reactivo (Ctrl-AlDeSense) para tener en cuenta la tinción fuera del objetivo. Esta herramienta selectiva de isoformas ya ha demostrado ser una herramienta química versátil a través de la detección de la actividad de ALDH1A1 en células de leucemia mielógena K562, mamosferas y xenoinjertos CSC derivados del melanoma. En este artículo, la utilidad de la sonda se mostró a través de fluorimetría adicional, microscopía confocal y experimentos de citometría de flujo donde se determinó la actividad relativa de ALDH1A1 en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario.
Introduction
Las células madre cancerosas (CSC) son una subpoblación de células tumorales que exhiben propiedades similares a las células madre1. Al igual que sus contrapartes no cancerosas, las CSC poseen la extraordinaria capacidad de autorrenovarse y proliferar. Junto con otros mecanismos incorporados, como la regulación positiva de los transportadores de casetes de unión a ATP, las CSC a menudo se salvan de los esfuerzos quirúrgicos iniciales de citorreducción, así como de la terapia adyuvante posterior2. Debido a su papel crítico en la resistencia al tratamiento3, la recaída4 y la metástasis5, las CSC se han convertido en una prioridad en la investigación del cáncer. A pesar de que hay una variedad de antígenos de superficie celular (por ejemplo, CD133) que pueden ser utilizados para identificar CSCs6, el aprovechamiento de la actividad enzimática de las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) encontradas en el citoplasma ha surgido como una alternativa atractiva7. Los ALDH son una superfamilia de 19 enzimas responsables de catalizar la oxidación de aldehídos endógenos y xenobióticos reactivos a los productos de ácido carboxílico correspondientes8.
En general, la desintoxicación de aldehído es crucial para proteger las células de eventos de reticulación indeseables y estrés oxidativo que pueden dañar la integridad de las células madre9. Además, la isoforma 1A1 controla el metabolismo del ácido retinoico, que a su vez influye en el tallo a través de la señalización del retinaldehído10. Recientemente se desarrolló AlDeSense 11,12, una sonda de detección basada en la actividad de moléculas pequeñas (ABS) para detectar selectivamente la actividad de ALDH1A1. Los diseños de ABS logran la detección de analitos a través de un cambio químico en lugar de un evento vinculante, lo que permite una alta selectividad y una disminución de las respuestas fuera del objetivo13,14,15,16. El principio de diseño de la sonda fluorogénica selectiva de isoforma se basa en un mecanismo de enfriamiento de transferencia de electrones fotoinducida por donante (d-PeT)17, originado en el grupo funcional aldehído, que sirve para suprimir la firma fluorescente de la sonda18. Tras la conversión mediada por ALDH1A1 al ácido carboxílico, la relajación radiativa se desbloquea para producir un producto altamente fluorescente. Debido a que el enfriamiento de d-PeT nunca es 100% eficiente, la fluorescencia residual que puede conducir a posibles resultados falsos positivos se consideró al establecer este ensayo a través del desarrollo de Ctrl-AlDeSense, un reactivo que no responde con características fotofísicas coincidentes (por ejemplo, rendimiento cuántico) y un patrón de tinción citoplasmática idéntico en las células. Cuando se usa en conjunto, este emparejamiento único puede distinguir de manera confiable las células con alta actividad ALDH1A1 de aquellas que exhiben niveles bajos a través de fluorimetría, imágenes moleculares y citometría de flujo. Varias ventajas clave están asociadas con el uso de colorantes activables selectivos de isoformas sobre los métodos inmunohistoquímicos tradicionales. Por ejemplo, se presume que las CSC están enterradas profundamente dentro de un tumor y, por lo tanto, son más accesibles a una molécula pequeña en relación con los anticuerpos grandes19. Además, el producto fluorescente volteado no modifica covalentemente ningún componente celular, lo que significa que se puede eliminar fácilmente a través de ciclos de lavado para dejar un CSC en un estado sin modificar. Por último, la respuesta de encendido solo identifica células y funciones viables, al igual que el ensayo MTT, debido a su dependencia del cofactor NAD +.
Figura 1: Esquema que demuestra el encendido fluorescente de AlDeSense. El colorante selectivo de isoforma es activado por ALDH1A1 y se puede utilizar para identificar la actividad elevada de ALDH1A1 en células de cáncer de ovario a través de fluorimetría, imágenes moleculares y citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En trabajos anteriores, el ensayo de sonda fluorogénica selectiva de isoformas estratificó con éxito células ALDH altas (ALDH +) de células ALDH bajas (ALDH-) en células de leucemia crónica humana K562, células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y células de melanoma murino B16F0. Esto es importante porque, para muchos tipos de cáncer, la expresión alta de la proteína ALDH1A1 significa un peor pronóstico clínico20. Esto supone que los niveles elevados de ALDH1A1 son indicativos de CSC que pueden evadir el tratamiento, desarrollar resistencia y diseminarse por todo el cuerpo. Sin embargo, en el caso del cáncer de ovario, hay estudios que reportan el hallazgo contrario (la alta expresión de ALDH1A1 está relacionada con una mejor supervivencia de la paciente)21,22,23,24. Si bien esto puede parecer contradictorio a primera vista, la expresión no necesariamente se correlaciona con la actividad enzimática, que puede estar influenciada por cambios en el microambiente tumoral (por ejemplo, flujo de pH, gradientes de oxígeno), disponibilidad del cofactor NAD + o sustratos aldehídos, niveles de ácidos carboxílicos (inhibición del producto) y modificaciones postraduccionales que pueden alterar la actividad enzimática25 . Además, el cáncer de ovario se divide en cinco tipos histológicos principales (seroso de alto grado, seroso de bajo grado, endometrioide, de células claras y mucinoso), que hipotetizamos que presentarán niveles variables de actividad ALDH1A126. Con el objetivo de investigar la actividad de ALDH1A1 en tumores de ovario, se empleó un ensayo de sonda fluorogénica selectiva de isoforma para identificar poblaciones de ALDH1A1+ en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario pertenecientes a los diferentes tipos histológicos mencionados anteriormente. Las líneas celulares probadas en este estudio incluyen células BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 y PEO4, que cubren histotipos de células claras y serosas. Aquí, se destacó la versatilidad y generalización de la sonda para identificar CSC para los investigadores que buscan realizar estudios similares en otras líneas celulares de cáncer inmortalizadas, así como muestras de pacientes. El uso de AlDeSense arrojará luz sobre las vías bioquímicas involucradas en el mantenimiento de CSC en microambientes tisulares complejos y potencialmente servirá como una herramienta clínica para determinar el pronóstico y medir la agresividad del cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
La panselectividad es una limitación importante de muchas sondas ALDH; Sin embargo, recientemente se han reportado varios ejemplos selectivos de isoformas 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM133581 a JC) y el Centro de Cáncer en Illinois Graduate Scholarship (otorgado a SG). JC agradece el apoyo de la Fundación Camille y Henry Dreyfus. Los autores agradecen al Dr. Thomas E. Bearrood por su contribución inicial a la preparación de las existencias de AlDeSense y AlDeSense AM. Agradecemos al Sr. Oliver D. Pichardo Peguero y al Sr. Joseph A. Forzano por su ayuda en la preparación de diversos precursores sintéticos. Agradecemos al Prof. Erik Nelson (Departamento de Fisiología Molecular e Integrativa, UIUC) por las células Caov-3, IGROV-1 y PEO4. Agradecemos al Prof. Paul Hergenrother (Departamento de Química, UIUC) por las células BG-1. Agradecemos a las instalaciones centrales del Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica por el acceso al microscopio confocal Zeiss LSM 700 y al software correspondiente. Agradecemos a la Flow Cytometry Facility por el acceso al analizador BD LSR II CMtO. Sandra McMasters y al Cell Media Facility por su ayuda en la preparación de los medios de cultivo celular.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
Referências
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