Anwendung von AlDeSense zur Stratifizierung von Eierstockkrebszellen basierend auf der Aktivität der Aldehyddehydrogenase 1A1

Summary

Methoden zur Messung der Aktivität von ALDH1A1 in lebenden Zellen sind in der Krebsforschung von entscheidender Bedeutung, da es ein Biomarker für die Stammzellbildung ist. In dieser Studie verwendeten wir eine isoformselektive fluorogene Sonde, um die relativen Konzentrationen der ALDH1A1-Aktivität in einem Panel von fünf Eierstockkrebszelllinien zu bestimmen.

Abstract

Ein Rückfall nach einer Krebsbehandlung wird oft auf die Persistenz einer Subpopulation von Tumorzellen zurückgeführt, die als Krebsstammzellen (CSCs) bekannt sind und sich durch ihre bemerkenswerte Fähigkeit zur Tumorinitiierung und Selbsterneuerung auszeichnen. Abhängig von der Herkunft des Tumors (z. B. Eierstöcke) kann das Profil des CSC-Oberflächen-Biomarkers stark variieren, was die Identifizierung solcher Zellen durch immunhistochemische Färbung zu einem schwierigen Unterfangen macht. Im Gegensatz dazu hat sich die Aldehyddehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) aufgrund ihres konservierten Expressionsprofils in fast allen Vorläuferzellen, einschließlich CSCs, als hervorragender Marker zur Identifizierung von CSCs erwiesen. Die Isoform ALDH1A1 gehört zu einer Superfamilie von 19 Enzymen, die für die Oxidation verschiedener endogener und xenobiotischer Aldehyde zu den entsprechenden Carbonsäureprodukten verantwortlich sind. Chan et al. haben kürzlich AlDeSense entwickelt, eine isoformselektive “Einschaltsonde” zum Nachweis der ALDH1A1-Aktivität, sowie ein nicht-reaktives Matching-Kontrollreagenz (Ctrl-AlDeSense), um Off-Target-Färbungen zu berücksichtigen. Dieses isoformselektive Werkzeug hat sich bereits durch den Nachweis der ALDH1A1-Aktivität in myeloischen K562-Leukämiezellen, Mammosphären und aus Melanomen gewonnenen CSC-Xenotransplantaten als vielseitiges chemisches Werkzeug erwiesen. In diesem Artikel wurde der Nutzen der Sonde durch zusätzliche Fluorimetrie-, konfokale Mikroskopie- und Durchflusszytometrie-Experimente demonstriert, bei denen die relative ALDH1A1-Aktivität in einem Panel von fünf Eierstockkrebszelllinien bestimmt wurde.

Introduction

Krebsstammzellen (CSCs) sind eine Subpopulation von Tumorzellen, die stammzellähnliche Eigenschaften aufweisen¹. Ähnlich wie ihre nicht-krebsartigen Gegenstücke besitzen CSCs die außergewöhnliche Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und zu vermehren. Zusammen mit anderen eingebauten Mechanismen, wie z.B. der Hochregulierung von ATP-bindenden Kassettentransportern, bleiben CSCs oft von anfänglichen chirurgischen Debulking-Anstrengungen sowie einer anschließenden adjuvanten Therapie verschont². Aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Behandlung^{von Resistenz 3}, Rezidiv⁴ und Metastasierung⁵ sind CSCs zu einer Priorität in der Krebsforschung geworden. Obwohl es eine Vielzahl von Zelloberflächenantigenen (z. B. CD133) gibt, die zur Identifizierung von CSCs verwendet werden können⁶, hat sich die Nutzung der enzymatischen Aktivität von Aldehyddehydrogenasen (ALDHs) im Zytoplasma^{als attraktive Alternative} 7 herausgestellt. ALDHs sind eine Superfamilie von 19 Enzymen, die für die Katalyse der Oxidation von reaktiven endogenen und xenobiotischen Aldehyden zu den entsprechenden Carbonsäureprodukten verantwortlich sind⁸.

Im Allgemeinen ist die Entgiftung von Aldehyden von entscheidender Bedeutung, um die Zellen vor unerwünschten Vernetzungsereignissen und oxidativem Stress zu schützen, die die Integrität der Stammzellen schädigen können⁹. Darüber hinaus steuert die 1A1-Isoform den Retinsäurestoffwechsel, der wiederum die Stammzellbildung über die Retinaldehyd-Signalübertragung^{beeinflusst 10}. AlDeSense ^11,12, eine aktivitätsbasierte Sensorsonde (ABS) mit kleinen Molekülen zum selektiven Nachweis der Aktivität von ALDH1A1, wurde kürzlich entwickelt. ABS-Designs erreichen die Detektion von Analyten durch eine chemische Veränderung und nicht durch ein Bindungsereignis, was eine hohe Selektivität und verringerte Off-Target-Reaktionen ermöglicht^13,14,15,16. Das Konstruktionsprinzip der isoformselektiven fluorogenen Sonde beruht auf einem Donor-Photo-induzierten Elektronentransfer (d-PeT)-Quenching-Mechanismus¹⁷, der von der funktionellen Gruppe des Aldehyds ausgeht und dazu dient, die fluoreszierende Signatur der Sonde¹⁸ zu unterdrücken. Bei der Umwandlung von ALDH1A1 in die Carbonsäure wird die Strahlungsrelaxation freigesetzt, um ein stark fluoreszierendes Produkt zu erhalten. Da die d-PeT-Abschreckung nie zu 100 % effizient ist, wurde die Restfluoreszenz, die zu möglichen falsch positiven Ergebnissen führen kann, bei der Etablierung dieses Assays durch die Entwicklung von Ctrl-AlDeSense berücksichtigt, einem nicht ansprechenden Reagenz mit übereinstimmenden photophysikalischen Eigenschaften (z. B. Quantenausbeute) und einem identischen zytoplasmatischen Färbemuster in Zellen. Bei gleichzeitiger Verwendung kann diese einzigartige Paarung mithilfe von Fluorimetrie, molekularer Bildgebung und Durchflusszytometrie zuverlässig Zellen mit hoher ALDH1A1-Aktivität von solchen unterscheiden, die niedrige Konzentrationen aufweisen. Die Verwendung von isoformselektiv aktivierbaren Farbstoffen gegenüber herkömmlichen immunhistochemischen Methoden bringt mehrere entscheidende Vorteile mit sich. Zum Beispiel wird angenommen, dass CSCs tief in einem Tumor vergraben sind und daher für ein kleines Molekül im Vergleich zu großen Antikörpern leichter zugänglich sind¹⁹. Darüber hinaus modifiziert das umgedrehte fluoreszierende Produkt keine zellulären Komponenten kovalent, was bedeutet, dass es leicht über Waschzyklen entfernt werden kann, um ein CSC in einem unveränderten Zustand zu belassen. Schließlich identifiziert die Einschaltreaktion nur lebensfähige Zellen und Funktionen, ähnlich wie beim MTT-Assay, da sie auf den NAD⁺-Kofaktor angewiesen ist.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Fluoreszenz-Einschaltens von AlDeSense. Der isoformselektive Farbstoff wird durch ALDH1A1 aktiviert und kann verwendet werden, um eine erhöhte ALDH1A1-Aktivität in Eierstockkrebszellen mittels Fluorimetrie, molekularer Bildgebung und Durchflusszytometrie zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

In früheren Arbeiten wurde mit dem isoformselektiven fluorogenen Sondenassay erfolgreich ALDH high (ALDH+) Zellen von ALDH low (ALDH-) Zellen in humanen K562 chronischen Leukämiezellen, MDA-MB-231 humanen Brustkrebszellen und B16F0 murinen Melanomzellen stratifiziert. Dies ist wichtig, da für viele Krebsarten eine hohe ALDH1A1-Proteinexpression eine schlechtere klinische Prognose bedeutet²⁰. Dies setzt voraus, dass erhöhte ALDH1A1-Spiegel auf CSCs hinweisen, die sich der Behandlung entziehen, Resistenzen entwickeln und sich im ganzen Körper ausbreiten können. Im Fall von Eierstockkrebs gibt es jedoch Studien, die das Gegenteil belegen (eine hohe ALDH1A1-Expression ist mit einem verbesserten Überleben der Patientin verbunden)^21,22,23,24. Auch wenn dies auf den ersten Blick widersprüchlich erscheinen mag, korreliert die Expression nicht unbedingt mit der Enzymaktivität, die durch Veränderungen der Tumormikroumgebung (z. B. pH-Fluss, Sauerstoffgradienten), die Verfügbarkeit des NAD⁺-Cofaktors oder der Aldehydsubstrate, den Gehalt an Carbonsäuren (Produkthemmung) und posttranslationale Modifikationen, die die Enzymaktivität verändern können, beeinflusst werden kann²⁵ . Darüber hinaus wird das Ovarialkarzinom in fünf histologische Haupttypen unterteilt (hochgradig serös, niedriggradig serös, endometrioid, klarzellig und muzinös), von denen wir annehmen, dass sie unterschiedliche Konzentrationen der ALDH1A1-Aktivität aufweisen²⁶. Mit dem Ziel, die Aktivität von ALDH1A1 in Ovarialtumoren zu untersuchen, wurde ein isoformselektiver fluorogener Sondenassay verwendet, um ALDH1A1+-Populationen in einem Panel von fünf Ovarialkarzinomzelllinien zu identifizieren, die zu den verschiedenen oben genannten histologischen Typen gehören. Zu den in dieser Studie getesteten Zelllinien gehören BG-1-, Caov-3-, IGROV-1-, OVCAR-3- und PEO4-Zellen, die klare Zell- und seröse Histotypen abdecken. Hier wurde die Vielseitigkeit und Generalisierbarkeit der Sonde hervorgehoben, um CSCs für die Forscher zu identifizieren, die ähnliche Studien in anderen immortalisierten Krebszelllinien sowie in Patientenproben durchführen möchten. Der Einsatz von AlDeSense wird Aufschluss über die biochemischen Signalwege geben, die an der Aufrechterhaltung von CSC in komplexen Gewebemikroumgebungen beteiligt sind, und möglicherweise als klinisches Werkzeug zur Bestimmung der Prognose und Messung der Krebsaggressivität dienen.

Protocol

1. Messung der Gesamtaktivität von ALDH1A1 in Homogenaten von Eierstockkrebszellen mittels Fluorimetrie Tauen Sie 1 × 106 Zellen in einem T25-Zellkulturkolben in 5 ml der folgenden Zellkulturmedien auf:IGROV-1 und PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S). BG-1 und Caov-3: Dulbeccos Modified Eagle’s Medium (DMEM) mit 10% FBS und 1% P/S. OVCAR-3: RPMI 1640…

Representative Results

Gesamtaktivität von ALDH1A1 in Homogenaten von EierstockkrebszellenDie durchschnittlichen Fold Turn-Ons für jede Zelllinie, die aus diesem Assay erhalten wurden, sind: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); und OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Abbildung 2). Abbildung <strong…

Discussion

Die Pan-Selektivität ist eine wesentliche Einschränkung vieler ALDH-Sonden. In jüngster Zeit wurden jedoch mehrere isoformselektive Beispiele berichtet (32,33,34,35,36,37,38,39,40,41).…

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25-050-CI
1x Phosphate Buffer Saline	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Synthesized in-house
BG-1			A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Flask	Thermo Fisher Scientific	130189
Biosafety Cabinet 1300 series A2	Thermo Fisher Scientific
Caov-3			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Cell homogenizer	Fisher Scientific
Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			Synthesized in-house
DMEM, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL	Corning	352003
FCS Express 6			Provided by UIUC CMtO
FL microscope	EVOS
Fluorometer	Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System	Thermo Fisher Scientific	155383
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin			Prepared by UIUC cell media facility