Anvendelse av AlDeSense for å stratifisere eggstokkreftceller basert på aldehyddehydrogenase 1A1-aktivitet

Summary

Metoder for å måle ALDH1A1-aktivitet i levende celler er kritiske i kreftforskning på grunn av sin status som en biomarkør for stamme. I denne studien benyttet vi en isoform-selektiv fluorogen sonde for å bestemme de relative nivåene av ALDH1A1-aktivitet i et panel med fem eggstokkreftcellelinjer.

Abstract

Tilbakefall etter kreftbehandling tilskrives ofte utholdenheten til en underpopulasjon av tumorceller kjent som kreftstamceller (CSC), som er preget av deres bemerkelsesverdige tumorinitierende og selvfornyelseskapasitet. Avhengig av opprinnelsen til svulsten (f.eks. Eggstokkene), kan CSC-overflatens biomarkørprofil variere dramatisk, noe som gjør identifisering av slike celler via immunhistokjemisk farging en utfordrende innsats. Tvert imot har aldehyddehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) dukket opp som en utmerket markør for å identifisere CSC, på grunn av sin konserverte ekspresjonsprofil i nesten alle stamceller, inkludert CSC. ALDH1A1-isoformen tilhører en superfamilie av 19 enzymer som er ansvarlige for oksydasjonen av forskjellige endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende karboksylsyreproduktene. Chan et al. utviklet nylig AlDeSense, en isoform-selektiv “turn-on” sonde for påvisning av ALDH1A1-aktivitet, samt et ikke-reaktivt matchende kontrollreagens (Ctrl-AlDeSense) for å ta hensyn til farging utenfor målet. Dette isoformselektive verktøyet har allerede vist seg å være et allsidig kjemisk verktøy gjennom påvisning av ALDH1A1-aktivitet i K562 myelogene leukemiceller, mammosfærer og melanomavledede CSC-xenotransplantater. I denne artikkelen ble sondens nytte vist gjennom ytterligere fluorimetri, konfokalmikroskopi og flowcytometrieksperimenter der den relative ALDH1A1-aktiviteten ble bestemt i et panel med fem eggstokkreftcellelinjer.

Introduction

Kreft stamceller (CSC) er en underpopulasjon av tumorceller som viser stamcellelignende egenskaper¹. I likhet med deres ikke-kreftfremkallende kolleger har CSC-er den ekstraordinære evnen til selvfornyelse og spredning. Sammen med andre innebygde mekanismer, som oppregulering av ATP-bindende kassetttransportører, blir CSC ofte spart for innledende kirurgisk debulking, så vel som påfølgende adjuvant behandling². På grunn av deres kritiske rolle i behandlingsresistens³, tilbakefall⁴ og metastase⁵, har CSC blitt en prioritet i kreftforskning. Selv om det finnes en rekke celleoverflateantigener (f.eks. CD133) som kan brukes til å identifisere CSC⁶, har utnyttelse av den enzymatiske aktiviteten til aldehyddehydrogenaser (ALDH) funnet i cytoplasma dukket opp som et attraktivt alternativ⁷. ALDH er en superfamilie av 19 enzymer som er ansvarlige for å katalysere oksidasjonen av reaktive endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende karboksylsyreproduktene⁸.

Generelt er aldehydavgiftning avgjørende for å beskytte celler mot uønskede kryssbindingshendelser og oksidativt stress som kan skade stamcellenes integritet⁹. Videre styrer 1A1-isoformen retinsyremetabolismen, som igjen påvirker stammen via retinaldehydsignalering¹⁰. AlDeSense ^11,12, en liten molekylær aktivitetsbasert sensing (ABS) sonde for selektivt å oppdage ALDH1A1-aktivitet^, ble nylig utviklet. ABS-design oppnår analyttdeteksjon gjennom en kjemisk endring i stedet for en bindingshendelse, noe som muliggjør høy selektivitet og reduserte responser utenfor målet^13,14,15,16. Designprinsippet for den isoformselektive fluorogene sonden er avhengig av en donor-fotoinducert elektronoverføring (d-PeT) slukkemekanisme¹⁷, som stammer fra den aldehydfunksjonelle gruppen, som tjener til å undertrykke sondens fluorescerende signatur¹⁸. Ved ALDH1A1-mediert omdannelse til karboksylsyre låses strålingen opp for å gi et svært fluorescerende produkt. Fordi d-PeT-slukking aldri er 100% effektiv, ble den gjenværende fluorescensen som kan føre til mulige falske positive resultater vurdert ved etablering av denne analysen gjennom utvikling av Ctrl-AlDeSense, et ikke-responsivt reagens med matchende fotofysiske egenskaper (f.eks. kvanteutbytte) og et identisk cytoplasmatisk fargemønster i celler. Når den brukes i tandem, kan denne unike sammenkoblingen pålitelig skille celler med høy ALDH1A1-aktivitet fra de som viser lave nivåer via fluorimetri, molekylær avbildning og flowcytometri. Flere viktige fordeler er forbundet med bruk av isoformselektive aktiverbare fargestoffer i forhold til tradisjonelle immunhistokjemiske metoder. For eksempel antas CSC å bli begravet dypt inne i en svulst, og dermed er mer tilgjengelig for et lite molekyl i forhold til store antistoffer¹⁹. I tillegg modifiserer ikke det omslåtte fluorescerende produktet kovalent noen cellulær komponent, noe som betyr at det lett kan fjernes via vaskesykluser for å forlate en CSC i umodifisert tilstand. Til slutt identifiserer turn-on-responsen bare levedyktige celler og funksjoner, omtrent som MTT-analysen, på grunn av sin avhengighet av NAD ⁺ -kofaktoren.

Figur 1: Skjematisk demonstrasjon av fluorescerende påkjøring av AlDeSense. Det isoformselektive fargestoffet aktiveres av ALDH1A1 og kan brukes til å identifisere forhøyet ALDH1A1-aktivitet i eggstokkreftceller via fluorimetri, molekylær avbildning og flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I tidligere arbeid har isoform-selektiv fluorogen sondeanalyse vellykket stratifisert ALDH høye (ALDH +) celler fra ALDH lave (ALDH-) celler i K562 humane kroniske leukemiceller, MDA-MB-231 humane brystkreftceller og B16F0 murine melanomceller. Dette er viktig fordi høyt ALDH1A1-proteinuttrykk for mange krefttyper betyr en dårligere klinisk prognose²⁰. Dette forutsetter at forhøyede nivåer av ALDH1A1 er en indikasjon på CSC som kan unngå behandling, utvikle resistens og spre seg gjennom hele kroppen. Når det gjelder eggstokkreft, er det imidlertid studier som rapporterer motsatt funn (høyt ALDH1A1-uttrykk er knyttet til forbedret pasientoverlevelse)^21,22,23,24. Selv om dette kan virke motstridende ved første øyekast, korrelerer ikke ekspresjon nødvendigvis med enzymaktivitet, som kan påvirkes av endringer i tumormikromiljøet (f.eks. pH-fluks, oksygengradienter), tilgjengeligheten av NAD ⁺ -kofaktoren eller aldehydsubstratene, nivåer av karboksylsyrer (produktinhibering) og posttranslasjonelle modifikasjoner som kan endre enzymaktivitet²⁵ . I tillegg er eggstokkreft delt inn i fem hovedhistologiske typer (høygradig serøs, lavgradig serøs, endometrioid, klar celle og mucinøs), som vi antar vil inneholde variable nivåer av ALDH1A1-aktivitet²⁶. Med mål om å undersøke ALDH1A1-aktivitet i eggstokktumorer, ble en isoform-selektiv fluorogen sondeanalyse ansatt for å identifisere ALDH1A1 + populasjoner i et panel av fem eggstokkreftcellelinjer som tilhører de forskjellige histologiske typene nevnt ovenfor. Cellelinjene som ble testet i denne studien inkluderer BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 og PEO4-celler, som dekker klare celle- og serøse histotyper. Her ble sondens allsidighet og generaliserbarhet fremhevet for å identifisere CSC for forskerne som søker å utføre lignende studier i andre immortaliserte kreftcellelinjer samt pasientprøver. Bruken av AlDeSense vil kaste lys over de biokjemiske veiene som er involvert i CSC-vedlikehold i komplekse vevsmikromiljøer og potensielt tjene som et klinisk verktøy for å bestemme prognose og måle kreftaggressivitet.

Protocol

1. Mål total ALDH1A1-aktivitet i ovariekreftcellehomogenater via fluorimetri Tine 1 × 106 celler i en T25 cellekulturkolbe i 5 ml av følgende cellekulturmedier:IGROV-1 og PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S). BG-1 og Caov-3: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% P/S. OVCAR-3: RPMI 1640 med 20% FBS, 1% P/S og 0,01 mg/ml insulin….

Representative Results

Total ALDH1A1-aktivitet av ovariekreftcellehomogenaterDe gjennomsnittlige foldekampanjene for hver cellelinje oppnådd fra denne analysen er: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1, 72 ± 0, 06); PEO4 (2,51 ± 0,29); og OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figur 2). Figur 2 Fo…

Discussion

Pan-selektivitet er en stor begrensning for mange ALDH-sonder; Imidlertid har flere isoform-selektive eksempler nylig blitt rapportert 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Den isoformselektive …

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25-050-CI
1x Phosphate Buffer Saline	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Synthesized in-house
BG-1			A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Flask	Thermo Fisher Scientific	130189
Biosafety Cabinet 1300 series A2	Thermo Fisher Scientific
Caov-3			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Cell homogenizer	Fisher Scientific
Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			Synthesized in-house
DMEM, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL	Corning	352003
FCS Express 6			Provided by UIUC CMtO
FL microscope	EVOS
Fluorometer	Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System	Thermo Fisher Scientific	155383
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin			Prepared by UIUC cell media facility