Aplicação do AlDeSense na Estratificação de Células de Câncer de Ovário com Base na Atividade da Aldeído Desidrogenase 1A1

Summary

Métodos para medir a atividade de ALDH1A1 em células vivas são críticos na pesquisa do câncer devido ao seu status como um biomarcador de tronco. Neste estudo, empregamos uma sonda fluorogênica isoforme-seletiva para determinar os níveis relativos de atividade de ALDH1A1 em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário.

Abstract

A recidiva após o tratamento do câncer é frequentemente atribuída à persistência de uma subpopulação de células tumorais conhecidas como células-tronco cancerosas (CSCs), que são caracterizadas por sua notável capacidade de iniciação tumoral e auto-renovação. Dependendo da origem do tumor (por exemplo, ovários), o perfil de biomarcadores de superfície da CSC pode variar drasticamente, tornando a identificação de tais células por meio de coloração imuno-histoquímica um esforço desafiador. Ao contrário, a aldeído desidrogenase 1A1 (ALDH1A1) tem emergido como um excelente marcador para identificar CSCs, devido ao seu perfil de expressão conservado em quase todas as células progenitoras, incluindo CSCs. A isoforma ALDH1A1 pertence a uma superfamília de 19 enzimas que são responsáveis pela oxidação de vários aldeídos endógenos e xenobióticos aos produtos correspondentes do ácido carboxílico. desenvolveram recentemente o AlDeSense, uma sonda “turn-on” isoform-seletiva para a detecção da atividade de ALDH1A1, bem como um reagente de controle de correspondência não reativo (Ctrl-AlDeSense) para explicar a coloração fora do alvo. Esta ferramenta isoform-seletiva já demonstrou ser uma ferramenta química versátil através da detecção da atividade de ALDH1A1 em células de leucemia mielóide K562, mamosferas e xenoenxertos CSC derivados de melanoma. Neste artigo, a utilidade da sonda foi mostrada através de experimentos adicionais de fluorimetria, microscopia confocal e citometria de fluxo, onde a atividade relativa de ALDH1A1 foi determinada em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário.

Introduction

As células-tronco cancerosas (CSCs) são uma subpopulação de células tumorais que exibem propriedades semelhantes às células-tronco¹. Semelhante aos seus homólogos não cancerosos, os CSCs possuem a extraordinária capacidade de se auto-renovar e proliferar. Juntamente com outros mecanismos incorporados, como a regulação positiva dos transportadores de de ligação de ATP, as CSCs são frequentemente poupadas dos esforços iniciais de remoção cirúrgica, bem como da terapia adjuvante subsequente². Devido ao seu papel crítico na resistência ao tratamento³, recidiva⁴ e metástase⁵, as CSCs tornaram-se uma prioridade na pesquisa do câncer. Embora haja uma variedade de antígenos de superfície celular (por exemplo, CD133) que podem ser usados para identificar CSCs⁶, alavancar a atividade enzimática de aldeídos desidrogenases (ALDHs) encontradas no citoplasma tem emergido como uma alternativa atraente⁷. ALDHs são uma superfamília de 19 enzimas responsáveis por catalisar a oxidação de aldeídos endógenos e xenobióticos reativos aos produtos correspondentes do ácido carboxílico⁸.

Em geral, a desintoxicação de aldeídos é crucial na proteção das células contra eventos indesejáveis de ligações cruzadas e estresse oxidativo que podem danificar a integridade das células-tronco⁹. Além disso, a isoforma 1A1 controla o metabolismo do ácido retinóico, que por sua vez influencia a haste via sinalização retinaldeído¹⁰. O AlDeSense 11,12, uma sonda de detecção baseada em atividade de pequenas moléculas (ABS) para detectar seletivamente a atividade de ALDH1A1^, foi recentemente desenvolvido. Os projetos em ABS alcançam a detecção do analito através de uma mudança química em vez de um evento de ligação, permitindo alta seletividade e diminuição das respostas fora do alvo^13,14,15,16. O princípio de projeto da sonda fluorogênica seletiva de isoformas baseia-se em um mecanismo de têmpera de transferência de elétrons (d-PeT) doador-fotoinduzido¹⁷, originário do grupo funcional aldeído, que serve para suprimir a assinatura fluorescente da sonda¹⁸. Após a conversão mediada por ALDH1A1 para o ácido carboxílico, o relaxamento radiativo é desbloqueado para produzir um produto altamente fluorescente. Como a têmpera d-PeT nunca é 100% eficiente, a fluorescência residual que pode levar a possíveis resultados falso-positivos foi considerada ao estabelecer este ensaio através do desenvolvimento de Ctrl-AlDeSense, um reagente não responsivo com características fotofísicas correspondentes (por exemplo, rendimento quântico) e um padrão de coloração citoplasmático idêntico nas células. Quando usado em conjunto, este emparelhamento único pode distinguir de forma confiável células com alta atividade de ALDH1A1 daquelas que exibem baixos níveis via fluorimetria, imagem molecular e citometria de fluxo. Várias vantagens importantes estão associadas ao uso de corantes ativados por isoforma seletiva em relação aos métodos tradicionais de imuno-histoquímica. Por exemplo, as CSCs são hipotetizadas para serem enterradas profundamente dentro de um tumor e, portanto, são mais acessíveis a uma molécula pequena em relação a anticorpos grandes¹⁹. Além disso, o produto fluorescente transformado não modifica covalentemente nenhum componente celular, o que significa que pode ser prontamente removido através de ciclos de lavagem para deixar um CSC em um estado não modificado. Por fim, a resposta ativada identifica apenas células e funções viáveis, assim como o ensaio MTT, devido à sua dependência do cofator NAD⁺.

Figura 1: Esquema demonstrando o acionamento fluorescente do AlDeSense. O corante isoform-seletivo é ativado pela ALDH1A1 e pode ser usado para identificar a atividade elevada da ALDH1A1 em células cancerosas do ovário via fluorimetria, imagem molecular e citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em trabalhos anteriores, o ensaio de sonda fluorogênica isoform-seletiva estratificada com sucesso em células ALDH altas (ALDH+) de células ALDH baixas (ALDH-) em células K562 de leucemia crônica humana, células de câncer de mama humano MDA-MB-231 e células de melanoma murino B16F0. Isso é importante porque, para muitos tipos de câncer, a alta expressão da proteína ALDH1A1 significa pior prognóstico clínico²⁰. Isso pressupõe que níveis elevados de ALDH1A1 são indicativos de CSCs que podem escapar do tratamento, desenvolver resistência e disseminar-se por todo o corpo. No entanto, no caso do câncer de ovário, há estudos relatando o achado oposto (alta expressão de ALDH1A1 está ligada à melhora da sobrevida das pacientes)^21,22,23,24. Embora isso possa parecer contraditório à primeira vista, a expressão não necessariamente se correlaciona com a atividade enzimática, que pode ser influenciada por mudanças no microambiente tumoral (por exemplo, fluxo de pH, gradientes de oxigênio), disponibilidade do cofator NAD⁺ ou substratos de aldeídos, níveis de ácidos carboxílicos (inibição do produto) e modificações pós-traducionais que podem alterar a atividade enzimática²⁵ . Além disso, o câncer de ovário é dividido em cinco tipos histológicos principais (seroso de alto grau, seroso de baixo grau, endometrioide, de células claras e mucinoso), os quais hipotetizamos que apresentarão níveis variáveis de atividade da ALDH1A126. Com o objetivo de investigar a atividade de ALDH1A1 em tumores ovarianos, um ensaio de sonda fluorogênica isoforme-seletiva foi empregado para identificar populações de ALDH1A1+ em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário pertencentes aos diferentes tipos histológicos mencionados acima. As linhagens celulares testadas neste estudo incluem células BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 e PEO4, cobrindo histotipos de células claras e serosas. Neste trabalho, destacou-se a versatilidade e a generalizabilidade da sonda para identificar CSCs para os pesquisadores que buscam realizar estudos semelhantes em outras linhagens de células cancerosas imortalizadas, bem como em amostras de pacientes. O uso do AlDeSense lançará luz sobre as vias bioquímicas envolvidas na manutenção da CSC em microambientes teciduais complexos e potencialmente servirá como uma ferramenta clínica para determinar o prognóstico e medir a agressividade do câncer.

Protocol

1. Medir a atividade total de ALDH1A1 em homogeneizados de células de câncer de ovário via fluorimetria Descongelar 1 × 106 células num balão de cultura de células T25 em 5 ml dos seguintes meios de cultura celular:IGROV-1 e PEO4: meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). BG-1 e Caov-3: Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de SFB e 1% de P/S. <l…

Representative Results

Atividade total de ALDH1A1 de homogeneizados de células cancerosas de ovárioAs dobras médias para cada linhagem celular obtidas neste ensaio são: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); e OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Figura 2). Figura 2<str…

Discussion

A pan-seletividade é uma limitação importante de muitas sondas ALDH; no entanto, vários exemplos de isoformas seletivas foram recentemente relatados 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. A s…

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25-050-CI
1x Phosphate Buffer Saline	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Synthesized in-house
BG-1			A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Flask	Thermo Fisher Scientific	130189
Biosafety Cabinet 1300 series A2	Thermo Fisher Scientific
Caov-3			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Cell homogenizer	Fisher Scientific
Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			Synthesized in-house
DMEM, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL	Corning	352003
FCS Express 6			Provided by UIUC CMtO
FL microscope	EVOS
Fluorometer	Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System	Thermo Fisher Scientific	155383
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S			Prepared by UIUC cell media facility
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin			Prepared by UIUC cell media facility