Denne protokollen beskriver genereringen av selvorganiserende blodkar fra humane pluripotente og induserte pluripotente stamceller. Disse blodkarnettverkene viser et omfattende og tilkoblet endotelnettverk omgitt av pericytter, glatt muskelaktin og en kontinuerlig kjellermembran.
En organoid er definert som et konstruert multicellulært in vitro-vev som etterligner det tilsvarende in vivo-organet slik at det kan brukes til å studere definerte aspekter av det organet i en vevskulturskål. Bredden og anvendelsen av human pluripotent stamcelle (hPSC) -avledet organoid forskning har avansert betydelig for å inkludere hjernen, netthinnen, tårekanalen, hjertet, lunge, tarm, bukspyttkjertel, nyre og blodkar, blant flere andre vev. Utviklingen av metoder for generering av humane mikrofartøyer har spesielt åpnet veien for modellering av utvikling av humane blodkar og sykdom in vitro og for testing og analyse av nye stoffer eller vevstropisme ved virusinfeksjoner, inkludert SARS-CoV-2. Komplekse og lange protokoller som mangler visuell veiledning, hindrer reproduserbarheten til mange stamcelleavledede organoider. I tillegg nødvendiggjør den iboende stokastisiteten til organoiddannelsesprosesser og selvorganisering generering av optiske protokoller for å fremme forståelsen av celleskjebneoppkjøp og programmering. Her presenteres en visuelt guidet protokoll for generering av 3D humane blodkarorganoider (BVOer) konstruert fra hPSCs. Ved å presentere en kontinuerlig kjellermembran, vaskulære endotelceller og organisert artikulasjon med veggmalericeller, viser BVO-er de funksjonelle, morfologiske, og molekylære egenskapene til human mikrovaskulatur. BVO-dannelse initieres gjennom aggregatdannelse, etterfulgt av mesoderm og vaskulær induksjon. Vaskulær modning og nettverksdannelse initieres og støttes ved å legge inn aggregater i en 3D-kollagen og solubilisert kjellermembranmatrise. Menneskelige fartøynettverk dannes i løpet av 2-3 uker og kan videreutvikles i skalerbare kultursystemer. Det er viktig at BVOer transplanteres i immunkompromitterte musanastomose med den endogene musesirkulasjonen og spesifiserer i funksjonelle arterier, vener og arterioler. Den nåværende visuelt styrte protokollen vil fremme menneskelig organoidforskning, spesielt i forhold til blodkar i normal utvikling, vevvaskularisering og sykdom.
Vaskulær dysfunksjon og blodkarsykdommer presenterer markerte komplikasjoner i organfunksjoner. Kardiovaskulær sykdom (CVD) er den ledende dødsårsaken over hele verden1 og er også den primære medvirkende faktoren til å øke helsekostnadene i USA. Antallet tilfeller av CVD øker årlig, og et økende antall av disse tilfellene forekommer i yngre aldersgrupper (20-45 år)2. Flere in vivo-modeller er utviklet for å utforske utvikling og modning av blodkar, vaskulær sykdom og endoteldysfunksjon 3,4. For tiden kan metoder som kombinerer enkle og flere avstamningsdefinerte celler, enten avledet fra stamceller eller isolert fra voksenvev in vivo, skape vaskulære nettverk som replikerer aspekter av human vaskulær funksjon og anatomi 5,6. Blodkar har dukket opp som et av de første funksjonelle systemene under utvikling fra mesoderm, og de organiserer seg enten gjennom en monteringsprosess kalt “vaskulogenese” eller ved utvidelse og forgrening fra eksisterende kar, som kalles “angiogenese”7.
Ved å utnytte kraften i utviklingsbiologi og selvstyrt forsamling, rapporterte Wimmer et al. de første selvorganiserende 3D humane blodkarorganoider fra hPSCs som viser de funksjonelle, morfologiske og molekylære egenskapene til menneskelig mikrovaskulatur8. I likhet med menneskelig vaskulatur9 genereres og presenteres disse hBVOene med et endotel, en kontinuerlig kjellermembran og omkringliggende veggmalericeller 8,10. hBVOene kan transplanteres in vivo og anastomoseres med den endogene sirkulasjonen. De kan også gjennomgå modning in vitro og tjene som modeller for kardiovaskulære sykdommer (dvs. diabetes)8 eller vevstropisme i virusinfeksjoner som SARS-CoV-211. Mens vi tidligere publiserte en skriftlig protokoll10, finnes det ingen tilgjengelig videoprotokoll for denne ellers komplekse teknikken.
Gjennom en kortfattet trinnvis progresjon oppnås hBVO-dannelse gjennom aggregatdannelse, mesoderminduksjon ved bruk av en WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) og benmorfogent protein – 4 (BMP4)12,13, vaskulær induksjon via vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA) og Forskolin (Fors)12, og innebygging i en tilpasset spirematrise 8,10. Vaskulær modning og nettverksdannelse følger innebygging av aggregatene i spirematrisen. Disse menneskelige fartøynettverkene dannes innen 2-3 uker og kan fjernes fra spirematrisen og videre vokse i skalerbare kultursystemer i opptil 6 måneder. Her er optisk veiledede prosedyrer gitt for dannelse og anvendelse av human stamcelleavledet vaskulatur.
Nylige gjennombrudd i stamcelleavledede organoidkulturer har gitt rammen for mer avanserte og fysiologisk relevante modeller av menneskelig vaskulatur. Den humane blodkarorganoidmodellen (hBVO) som presenteres her, utviklet i vårt laboratorium 8,10, gir et kraftig middel til å utforske ikke bare ytterligere aspekter av human vaskulogenese, men også nye veier for sykdomsmodellering og regenerativ terapi 8,10,11. Flere in vivo-modeller har blitt brukt til å utforske utvikling og modning av blodkar, vaskulær sykdom og endoteldysfunksjon 3,4. Varierende tilnærminger kombinerer enkle og flere avstamningsdefinerte celler enten avledet fra stamceller eller isolert fra voksne vev in vivo for å skape replikerende humane vaskulære nettverk 5,6. Protokollen som presenteres her utnytter prinsippet om utviklingsbiologi og selvorganisering for å gi de første flercellede avstamningsnettverkene av menneskelige blodkar som i hovedsak kan genereres fra en enkelt hPSC 8,10.
Hver stamcellelinje har en unik genetisk sammensetning og skiller seg fra andre når det gjelder kilde, funksjon og respons15. Derfor ble protokollen for humane blodkarorganoider (hBVOer) utviklet og optimalisert for å sikre en robust og reproduserbar protokollkompatibilitet med flere (>12) forskjellige hPSC-linjer 8,10. Metoden beskrevet her genererer hPSC-avledede blodkarorganoider over 2 uker. Imidlertid kan endringer i mediesammensetningen og eller teknikkene i hBVO-generering føre til ineffektivt fartøynettverk og organoidgenerering. De varierende proliferasjonshastighetene av individuelle stamcellelinjer påvirker også reproduserbarheten av stamcelleeksperimenter15 og dermed organoidkulturer. For eksempel, ved generering av BVOer, er flere proliferative celler eller høyere antall store dag 1-aggregater iboende gjenstand for forskjellige metabolske miljøer og gass- og næringsdiffusjonsparametere. Dette endrer i sin tur vekstfaktoreksponeringstider og effektivitet, graden av differensiering og vaskulær priming, og, viktigst av alt, evnen til å danne fartøynettverk ved innebygging av aggregatene i kollagen 1 og solubilisert kjellermembranmatrise.
Den passive diffusjonen av oksygen og administrering av essensielle næringsstoffer fra et eksternt miljø er ikke ideell for langsiktig cellevekst av 3D-organoider og vevsmorfogenese in vitro16. Selv om det er avhengig av flere faktorer (dvs. vevets metabolske hastighet, nærings- og gassbiotilgjengeligheten, et statisk eller dynamisk miljø), er det etablert en generell 150 μmO2 og næringsdiffusjonsgrense for vev dyrket in vitro, med tanke på at fysiologisk humant vev presenterer ledninger av levende celler innen 150 μm perfuserte blodkar17. Selv om effektive gass- og næringsdiffusjonsavstander på 70-200 μm også har blitt foreslått18,19,20,21, påvirker konstruksjonstettheten, temperaturen, pH og mediesammensetningen diffusjonseffekten betydelig. På grunn av overflatearealoptimalisering og integrin-beta-reseptorkommunikasjon etter dag 6-innebygging, fungerer aggregater på 250-300 μm i diameter bedre enn de >500-600 μm i diameter, noe som resulterer i en komplett spiringsprosess og en minimalt kondensert organoidkjerne. Dermed er den samlede størrelsen avgjørende og kan påvirkes av både antall celler som brukes under den første såingen og tiden som er tildelt for aggregatdannelse. Microwell-plater som tillater kontroll over aggregatstørrelse og antall22 er et levedyktig alternativ til den ellers stokastiske aggregatdannelsesteknikken som følge av bruk av 6-brønnsplater med ultralavt feste i denne protokollen. Konsistens i timing og styring av de samlede størrelsene i løpet av de første 6 dagene av hBVO-protokollen er en av, om ikke den mest, avgjørende indikatorene for vellykket utvikling av bona fide blodkarorganoider.
Middels forandringer dag 1 (mesoderminduksjon) og dag 4 (vaskulær induksjon) må fullføres i kombinasjon med sedimentering av aggregatene. Selv om sentrifugering er et fristende alternativ, kan de ekstra kreftene som påføres de svakt monterte aggeratene forårsake uønsket klumping, montering og skjæring, noe som negativt påvirker differensiering, modning og spiringseffektivitet i de senere stadiene av protokollen. Arbeid på is i dag 6 innebyggingsprosess er avgjørende for å bevare riktig ECM-polymerisering og lagdannelse. Under den samlede innebyggings- og spiringsinduksjonen vil eksponering av ECM for temperaturer over 4 °C og/eller en ECM pH annet enn 7,4 ikke bare påvirke polymerisasjonshastighetene og ECM-lagsintegriteten, men også spiringseffektiviteten til de innebygde aggregatene. Den elastiske naturen til ECM-spirematrisen muliggjør enkel løsrivelse og transport fra 12-brønnskulturskålen til den sterile skjæreflaten. Individuelle organoider fjernet fra matrisen og overført til 96-brønnsplater med ultralavt vedlegg vil konsumere de gjenværende omkringliggende ECM og beholde selvorganiserte veggmalericellebelagte endotelmikrofartøynettverk med en kontinuerlig kjellermembran.
Selv om det ikke dekkes av dette forslaget, kan endringer i mediesammensetningene replikere sykdommer som igjen provoserer patologiske responser i hBVOs 8,11. Grensene for sykdomsmodellering ved hjelp av hBVO-systemet er langt fra kjent, og dette er absolutt et område som trenger utforskning. Anvendelsen av vår blodkarorganoidteknologi i vaskularisering av tidligere avaskulære organoidkonstruksjoner23 er også av betydelig innvirkning og interesse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer av våre laboratorier for kritiske innspill og diskusjoner. JMP mottok finansiering fra T. von Zastrow-stiftelsen, FWF Wittgenstein-prisen (Z 271-B19), det østerrikske vitenskapsakademiet, Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) under tilskuddsavtale No 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program og Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 samt Canadian Institutes of Health Research COVID-19-tilskudd F20-02343 og F20-02015.
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |