Her beskriver vi et enkelt å implementere, standardisert, mikrofysiologisk system som gjenspeiler kompleksiteten til den menneskelige benmargens in vivo-struktur , og gir en relevant modell for å studere et bredt spekter av normale og patologiske hendelser.
Den medulære nisje er et komplekst økosystem som er viktig for å opprettholde homeostase for bosatte celler. Faktisk er benmargen, som inkluderer en kompleks ekstracellulær matrise og forskjellige celletyper, som mesenkymale stamceller, osteoblaster og endotelceller, dypt involvert i hematopoietisk stamcelleregulering gjennom direkte celle-celle-interaksjoner, samt cytokinproduksjon. For å nøye etterligne denne in vivo-strukturen og gjennomføre eksperimenter som reflekterer responsene til den menneskelige benmargen, har flere 3D-modeller blitt opprettet basert på biomaterialer, hovedsakelig avhengig av primære stromale celler. Her beskrives en protokoll for å oppnå et minimalt og standardisert system som er enkelt å sette opp og gir funksjoner i benmargslignende struktur, som kombinerer forskjellige cellepopulasjoner, inkludert endotelceller, og reflekterer heterogeniteten til in vivo benmargsvev. Denne 3D-benmargslignende strukturen som er montert ved hjelp av kalsiumfosfatbaserte partikler og humane cellelinjer, som er representativ for benmargsmikromiljøet – tillater overvåking av et bredt spekter av biologiske prosesser ved å kombinere eller erstatte forskjellige primære cellepopulasjoner i systemet. De endelige 3D-strukturene kan da enten høstes for bildeanalyse etter fiksering, parafininnbygging og histologisk/immunhistokjemisk farging for cellelokalisering i systemet, eller dissosieres for å samle hver cellulær komponent for molekylær eller funksjonell karakterisering.
Benmarg (BM) finnes i både de sentrale hulrommene i aksiale og lange bein og trabekulære flate bein, og inneholder en rekke forskjellige cellulære og ikke-cellulære komponenter. På strukturelt nivå består den av hematopoietiske vevsøyer (også kalt “hematoner”)1,2 og fettceller omgitt av vaskulære bihuler ispedd trabekulært bein3. I lange og flate bein er blodtilførselen til bein og benmarg sammenkoblet gjennom et endosteal nettverk av fartøy4. Skjult i dette solide beskyttende nettverket, er BM vert for svært umodne celler nedsenket i en svampete stroma og utgjør stedet for differensiering av bosatte mesenkymale stamceller (MSCs) og hematopoietiske stamceller (HSCs)5. Faktisk, bortsett fra fornyelse av beinvev gjennom produksjon av osteoblaster, ligger en av de viktigste kjente funksjonene til BM i hematopoiesis utvikling6.
BM hematopoietisk vev inkluderer en rekke celletyper, nemlig HSC, forløpere og mer differensierte blodceller som lymfocytter, nøytrofiler, erytrocytter, granulocytter, monocytter og trombocytter7. Hematopoietiske celler er ikke tilfeldig arrangert i BM-rommet, men viser en bestemt organisasjon innenfor hematopoietiske nisjer, som inkluderer mange celletyper av forskjellig opprinnelse (osteoblaster, osteoklaster, MSCs, adipocytter, sinusformet endotel og perivaskulære stromale celler, immunceller, nerveceller og forskjellige modne hematopoietiske celler), som danner en kompleks struktur for å sikre normal hematopoiesis8 . De biologiske funksjonene til den hematopoietiske nisjen inkluderer regulering av HSC-overlevelse, adhesjon, hvile, homing og differensiering gjennom forskjellige mekanismer (celle-celle- og cellematriseinteraksjoner, produksjon av løselige faktorer, hypoksi) som svar på flere fysiologiske eller ikke-fysiologiske påkjenninger 3,6. Selv om disse hematopoietiske nisjene i utgangspunktet ble oppfattet som homogene enheter, har teknologiske fremskritt som enkeltcelle- og bildebehandlingsanalyser gradvis avslørt deres kompleksitet, dynamikk og adaptive egenskaper 9,10,11.
Det avgjørende behovet for å erstatte og redusere bruken av dyr for å dechiffrere menneskelige fysiologiske og patologiske prosesser fører til nye muligheter og utfordringer11,12. Blant nylig beskrevne in vitro-verktøy har tredimensjonale (3D) modeller som etterligner in vivo menneskelig BM bedre enn klassiske todimensjonale (2D) kulturer 13,14,15,16,17 blitt foreslått. 3D-modellering ser dermed ut til å være en lovende tilnærming for å observere celle-celle- og cellematriseinteraksjoner, nærmere de som forekommer in vivo. Ved hjelp av en rekke av disse modellene har noen lag demonstrert overlevelse og spredning av HSCs18,19. Flere 3D-modeller er tilgjengelige, den vanligste tilnærmingen er bruk av stillasbaserte 3D-biomaterialer som hydrogeler, kolloider eller kollagener, assosiert med MSCs som utnytter deres osteoblastiske avstamningsdifferensieringskapasiteter20,21,22. Likevel er det ikke oppnådd noe globalt samtykke for å oppfylle alle krav til studier på humane celler på en brukervennlig og standardisert måte23, spesielt siden disse nåværende 3D-systemene hovedsakelig er avhengige av primære stromale celler, og dermed lider av begrenset tilgang til primære prøver, vevstilgjengelighet og heterogenitet.
I tillegg bør endotelcellerommet innføres da disse cellene representerer en viktig komponent i celle-celle-interaksjoner og er involvert i stamcelleskjebne og BM-sykdomsutvikling, både i leukemi24 og metastase25. Vi har tidligere rapportert at tillegg av patologiske elementer i en standardisert human 3D benmargsmodell rekapitulerer trekk observert i pasientprøver som ekstracellulær matriks (ECM) endringer26. For bedre å forstå dynamikken og samspillet mellom det menneskelige BM-mikromiljøet og de bosatte cellene, gir vi en detaljert protokoll for et brukervennlig og standardisert system for å bygge en minimal, velorganisert, BM-lignende struktur. Dette systemet består av tre humane benmargscelletyper – endotelceller og stromale celler, som representerer mikromiljøet, og HSCs. Ved å bruke spesifikke perler som et stillas og et osteoblastisk differensieringsmedium, vil den oppnådde 3D-strukturen etterligne den menneskelige medulære nisjen, noe som muliggjør en praktisk studie av menneskelig benmarg.
En av de nåværende utfordringene som studier på menneskelige fysiologiske og tilhørende patologiske problemer står overfor, er mangelen på modeller som nøyaktig etterligner de komplekse funksjonene til menneskelige organer. Når det gjelder menneskelige BM 3D-modeller, bruker mange modeller hydrogeler og delvis reproduserer BM, noe som illustrerer kraften i 3D-kulturforhold sammenlignet med klassiske 2D-kulturer for å sikre for eksempel en bedre osteoblastisk differensiering27,28. Likevel, til tross for god reproduserbarhet og brukervennlighet, etterligner disse systemene ikke den menneskelige BM 3D-strukturen og arkitekturen, noe som kan påvirke videre analyser betydelig. Teknologiske fremskritt har gjort det mulig for forskere å bedre reprodusere det innfødte humane osteoblastiske nisjemiljøet ved hjelp av et perfusjonsbasert bioreaktorsystem for å opprettholde noen HSC-egenskaper29. Utviklingen av mikrofluidiske enheter har ført til nye tilnærminger for å reprodusere en relevant benmargslignende struktur, men har hittil bare oppnådd begrensede egenskaper i benmargen, og har derfor begrenset applikasjoner30,31,32,33.
Fremskritt innen materialvitenskap har bidratt til utviklingen av et bredt spekter av naturlige eller syntetiske biomaterialer, som kan brukes til å utvikle relevante 3D-beinkultursystemer. Imidlertid er slike systemer noen ganger vanskelige å utvikle i standard biologiske laboratorier uten interne ferdigheter i biofysikk. Videre oppnår disse systemene i de fleste tilfeller en begrenset evne til å etterligne 3D-strukturen til det menneskelige beinet, inkludert BM-mikromiljøet, og har brukt store mengder cytokiner og vekstfaktorer, noe som skaper et kunstig rikt kulturmedium34.
Valget om å indusere osteoblastisk differensiering i stedet for adipocytisk differensiering var basert på det faktum at preosteoblaster og osteoblaster har blitt beskrevet som en del av endosteal nisje35. Dette identifiserte osteoblastiske celler som forespurte komponenter i både bein og benmarg. Blant de cellulære komponentene i benmargen opptar endotel- og stromalceller en stor del av mikromiljøet. I tillegg produserer disse to celletyper strukturelle ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrisen og cytokiner involvert i regulering av homeostase og differensiering, forespurt her for å generere en forkalket struktur. Dermed rettferdiggjør dette bruken av endotel- og stromale celler, og vårt valg av cellelinjer for å gi enkel tilgang og øke reproduserbarheten mellom laboratorier. Med kulturen til HMEC-1-linjen som er mer stabil over tid, ble denne cellelinjen beholdt for utviklingen av 3D-systemet. For stromale celler sammenlignet vi i 2D-kultur osteoblastdifferensieringskapasiteten til stromalcellelinjene avledet fra normal benmarg: HS5 og HS27A. Vi fant at HS5-linjen ikke differensierte så mye som HS27A-linjen i 3D-systemet generert med begge cellelinjene. I denne forbindelse har forsøk på å erstatte HS27A-celler med HS5-linjen resultert i produksjon av en mindre stiv struktur, noe som tyder på at HS27A er mer egnet.
Både HS27A- og HMEC-1-cellelinjer ble dyrket i forskjellige mediekombinasjoner, hvor man fremkaller den beste stive strukturen og justeringene av HMEC-1 langs osteoblaststrukturer, slik at produksjonen av den ekstracellulære matrisen gir en relativ stivhet til grunnstrukturen. Analyse av utviklingen av differensiering ved D14 viste at differensieringen var mer avansert ved D21 (måling av BSP, sen osteoblastisk markør), med forholdet 1: 2 for HMEC-1: HS27A og med bedre resultater når 2 × 106 HS27A ble introdusert. Endotelceller har også en viktig rolle i regulering av homeostase og differensiering (blant annet gjennom tilførsel av cytokiner). Det faktum at HMEC-1-celler opprettholdes i dette systemet indikerer at de i det minste kan oppfylle denne rollen, og dette bidrar til legitimiteten til modellen vår. For HMEC-1 endotellinjen var det viktig å introdusere den tidlig nok slik at den kunne integreres riktig i strukturen og med håp om at disse cellene kunne danne justeringer eller til og med rør i strukturen. Samkulturtester av HS27A og HMEC-1 ble utført ved å introdusere sistnevnte på forskjellige stadier: D0, D7, D14; Ingen merkbar forskjell ble observert, verken i differensieringen av stromalcellene eller i vedlikehold eller posisjonering av endotelcellene. Dermed ble disse cellene introdusert i begynnelsen av prosessen. Hematopoietiske celler ble introdusert på et tidspunkt da osteoblastisk differensiering ville være avansert nok til å favorisere celle-celle-interaksjoner. Dette valget ble også betinget av det faktum at denne osteoblastiske differensieringen er betinget av bruk av et medium, som ifølge våre tester ikke fullt ut støtter vedlikehold av hematopoietiske celler. Hematologiske celler kan enten være cellelinjer eller primære BM CD45 hematopoietiske celler.
Fra denne 3D-modellen kan vi se for oss å erstatte hver celletype med primære celler, normale eller patologiske, eller til og med å legge til andre celletyper for å øke biomimetiske egenskaper, for eksempel immunceller, adipocytter eller fibroblaster26. Faktisk har HS27A-cellelinjen blitt erstattet med primære BM MSC-er med lav passasje. Tilsvarende ble hematologiske cellelinjer erstattet med primære BM hematopoietiske celler. Imidlertid har erstatning av HMEC-1-celler av primære endotelceller ikke blitt testet ennå. For tiden kan denne modellen fortsatt forbedres når det gjelder vaskulaturrepresentasjon, som selv om endotelceller er tilstede og korrekt interagerer med andre celler fra mikromiljøet (f.eks. hematopoietiske celler), danner de ikke strukturerte kar, og utelukker dermed strømningsperfusjon for å etterligne funksjonelle blodkar. Samlet sett kan dette gradvis øke kompleksiteten og representativiteten til dagens minimale 3D-modell. Tilsetning av andre celletyper kan lette studier som undersøker andre problemer, for eksempel betydningen av lokal BM-betennelse eller motstand mot immunterapi.
Imidlertid trenger dette 3D-systemet 3 uker før celler av interesse, hematologiske celler eller epitelkreftceller hvis metastaseprosessen evalueres, kan legges til. Sterile forhold må opprettholdes, da middels endringer to ganger i uken noen ganger kan føre til middels forurensning. Videre, siden noen celler kan migrere gjennom porene i innsatsen og begynne å spre seg i brønnen, noe som fører til økt mediumforbruk, anbefales regelmessig overvåking.
Vi beskrev her et 3D-stillas som tillater osteoblastisk differensiering og utviklet et relevant, in vitro , 3D, menneskelig BM-lignende mikromiljø. Dette systemet tillater in situ-analyse og endelig gjenfinning av levende celler. Dette systemet gir et nytt og svært fleksibelt verktøy, reproduserbart og brukervennlig, med et bredt spekter av applikasjoner for å studere interaksjoner og mekanismer i det menneskelige BM-mikromiljøet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker P. Battiston-Montagne og A. Jambon fra CRCL-cytometriplattformen og N. Gadot og C. Leneve fra Research Pathology Platform, Institutt for translasjonsforskning og innovasjon, Centre Léon Bérard. Forfatterne takker B. Manship for den engelske utgaven. Dette arbeidet ble finansiert av Inserm og FI-LMC til V. M. S., og S. L. K. A. og L. B. ble støttet av et stipend fra Société Française d’Hématologie.
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |