インビトロ ヒアルロン酸に富む細胞外マトリックスが神経堤細胞遊走に及ぼす影響の検討
Summary
このプロトコルは、神経堤細胞のヒアルロナンに富む細胞外マトリックスへのin vivo移動に関与する分子の機能解析に適したin vitro移行実験の概要を示しています。
Abstract
神経堤細胞(NCC)は、神経管の背側領域に由来する高度に遊走する細胞です。神経管からのNCCの移行は、NCCの産生とその後の標的部位への移動に不可欠なプロセスです。周囲の神経管組織を含むNCCの移動経路には、ヒアルロン酸(HA)に富む細胞外マトリックスが含まれます。神経管からこれらのHAリッチな周辺組織へのNCC移行をモデル化するために、HA(平均分子量:1,200〜1,400 kDa)とコラーゲンI型(Col1)からなる混合基質移動アッセイがこの研究で確立されました。この遊走アッセイは、NCC細胞株O9-1細胞が混合基質上で高度に遊走性であり、HAコーティングが遊走の過程で局所接着部位で分解されることを示しています。この in vitro モデルは、NCC移行に関与する機構的基盤のさらなる探索に有用であり得る。このプロトコルは、NCCの移動を研究するための足場として異なる基質を評価するためにも適用できます。
Introduction
神経堤細胞(NCC)は、発生中の胚に存在する多能性細胞集団であり、神経形成中に神経板境界から発生します。それらは、末梢神経系、心血管系、頭蓋顔面組織、および骨格1を含む様々な組織の形成に寄与する。神経板境界での誘導とNCC仕様化の後、NCCは神経上皮から移動し、NCC由来の組織部位に向かって移動します1。
ヒアルロン酸(HA)は、細胞外マトリックス(ECM)の成分として様々な組織に分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。胚発生におけるHAの重要性は、ヒアルロン代謝に関与する遺伝子の切除を通じてモデルシステムで実証されています。たとえば、アフリカツメガエルのヒアルロン酸合成酵素遺伝子(Has1およびHas2)の変異は、NCCの移動障害と頭蓋顔面奇形につながることがわかりました2。また、HA結合プロテオグリカン、アグリカンおよびバーシカンが、NCC遊走に対して抑制効果を発揮することが報告されている3。マウスでは、Has2アブレーションは心内膜クッション形成に深刻な欠陥をもたらし、妊娠中期(E9.5-10)の致死性をもたらします4,5,6。
細胞表面ヒアルロニダーゼである膜貫通タンパク質2(Tmem2)は、接着部位のマトリックス関連HAを除去することにより、インテグリンを介した癌細胞の接着および遊走を促進する上で重要な役割を果たすことが最近実証されました7,8。最近では、Inubushiら9は、Tmem2の欠損がNCCの移動/移動および生存の異常により、重度の頭蓋顔面欠損につながることを実証しました。先行研究9では、NCC形成および遊走中のTmem2発現を解析した。Tmem2の発現は、NCC層間剥離部位およびSox9陽性NCCの遊走において観察された(図1)。さらに、Tmem2を枯渇させたマウスO9-1神経堤細胞を用いて、この研究では、Tmem2のin vitro発現が、O9-1細胞が局所接着を形成し、HA含有基質への移行に不可欠であることが実証されました(図2および図3)9。
これらの結果は、Tmem2がNCCの接着とHAリッチECMを介した移行にも重要であることを強く示しています。しかし、HAリッチECM内でのNCCの接着と移動の分子メカニズムはまだ不明です。したがって、HAリッチECM内のNCC接着と遊走を完全に探索するための in vitro 培養実験システムを確立する必要があります。
細胞遊走の試験に採用されている数多くのアプローチの中で、細胞創傷閉鎖ベースのアッセイは、生理学および腫瘍学の分野で頻繁に使用される簡単な方法です10。このアプローチは、 in vivo 表現型との関連性のために有用であり、細胞遊走中の薬物および化学誘引物質の役割を決定するのに有効である11。経時的な細胞間隙距離を測定することにより全細胞塊および個々の細胞の両方の遊走能を評価することができる11。この原稿では、神経管周囲のHAリッチ組織へのNCCの移動をモデル化するために、修正された in vitro 創傷閉鎖ベースのアッセイが導入されています。この手順は、NCC移行におけるECM足場の役割を分析するために、さまざまなECMコンポーネント(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど)を研究するためにも適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
さまざまなECMコンポーネントがNCCの移行/移行を規制します。たとえば、HAはNCC移行2,15を積極的に規制しています。興味深いことに、細胞表面ヒアルロニダーゼであるTmem2の遺伝子マウスモデルに基づく研究では、NCC遊走におけるHA分解の要件が解明されました9。コラーゲンは、神経管16を取り囲むECMにも豊富に存…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
入江文俊さんと山口悠さんには、この方法を確立するための励ましとご提案を賜り、心より感謝申し上げます。本研究は、日本学術振興会の科学研究費補助金(#19KK0232からT.I.、#20H03896からT.I.)の支援を受けて行われました。ガラス基板上へのHAのコーティングおよび基板上のin situHA分解アッセイの元の方法はYamamoto et al. (2017)8に記載され、HA/Col1混合基板の調製方法は入江ら(2021)7に記載されています。
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
Referências
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