체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사

Summary

이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

Abstract

신경능선세포(NCC)는 신경관의 등쪽 영역에서 유래하는 이동성이 높은 세포입니다. 신경관에서 NCC를 이동하는 것은 NCC 생산 및 표적 부위로의 후속 이동을 위한 필수 과정입니다. 주변 신경관 조직을 포함한 NCC의 이동 경로에는 히알루론산(HA)이 풍부한 세포외 기질이 포함됩니다. 신경관에서 이러한 HA가 풍부한 주변 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 HA(평균 분자량: 1,200-1,400kDa)와 콜라겐 유형 I(Col1)로 구성된 혼합 기질 이동 분석이 이 연구에서 확립되었습니다. 이 이동 분석은 NCC 세포주인 O9-1 세포가 혼합 기질에서 고도로 이동하며 HA 코팅이 이동 과정에서 국소 접착 부위에서 분해됨을 보여줍니다. 이 시험관 내 모델은 NCC 마이그레이션과 관련된 기계적 기반에 대한 추가 탐색에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 NCC 이동을 연구하기 위해 스캐폴드로 다양한 기질을 평가하는 데에도 적용할 수 있습니다.

Introduction

신경 능선 세포(NCC)는 발달 중인 배아에 존재하는 다능성 세포 집단이며 신경 형성 동안 신경판 경계에서 유래합니다. 그들은 말초 신경계, 심혈관계, 두개 안면 조직 및 골격을 포함한 다양한 조직의 형성에 기여합니다¹. 신경판 경계에서 유도 및 NCC 사양 후, NCC는 신경 상피에서 이동하여 NCC 유래 조직 부위로 이동합니다¹.

히알루론산(HA)은 세포외 기질(ECM)의 구성 요소로서 다양한 조직에 분포하는 비황산화 글리코사미노글리칸입니다. 배아 발달에서 HA의 중요성은 히알루론산 대사를 담당하는 유전자의 절제를 통해 모델 시스템에서 입증되었습니다. 예를 들어, 제노푸스(Xenopus)의 히알루론산 합성효소 유전자(Has1 및 Has2)의 돌연변이는 NCC 이동 결함과 두개안면 기형을 유발하는 것으로 밝혀졌다². 또한, HA 결합 프로테오글리칸인 아그레칸(aggrecan)과 베르시칸(versican)은 NCC 이동에 대한 억제 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다³. 마우스에서 Has2 절제는 심내막 쿠션 형성에 심각한 결함을 일으켜 임신 중기(E9.5-10) 치사율을 초래합니다 ^4,5,6.

세포 표면 히알루로니다아제인 막횡단 단백질 2(Tmem2)는 부착 부위 ^7,8에서 매트릭스 관련 HA를 제거하여 인테그린 매개 암세포 부착 및 이동을 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 최근 입증되었습니다. 보다 최근에, Inubushi et ^al.9는 Tmem2의 결핍이 NCC 이주/이주 및 생존의 이상으로 인해 심각한 두개안면 결함을 유발한다는 것을 입증했습니다. 이전 연구⁹에서, Tmem2 발현은 NCC 형성 및 이동 동안 분석되었다. Tmem2 발현은 NCC 박리 부위 및 이주하는 Sox9 양성 NCC에서 관찰되었습니다(그림 1). 또한, Tmem2가 고갈된 마우스 O9-1 신경 능선 세포를 사용하여 연구에서는 Tmem2의 시험관 내 발현이 O9-1 세포가 국소 유착을 형성하고 HA 함유 기질로 이동하는 데 필수적임을 입증했습니다(그림 2 및 그림 3)⁹.

이러한 결과는 Tmem2가 HA가 풍부한 ECM을 통한 NCC 접착 및 이동에도 중요하다는 것을 강력하게 나타냅니다. 그러나 HA가 풍부한 ECM 내에서 NCC 접착 및 이동의 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 따라서 HA가 풍부한 ECM 내에서 NCC 접착 및 이동을 완전히 탐색하기 위해 체외 배양 실험 시스템을 구축할 필요가 있습니다.

세포 이동을 검사하는 데 사용되는 수많은 접근법 중에서, 세포 상처 봉합 기반 분석법은 생리학 및 종양학 분야에서 자주 사용되는 간단한 방법이다¹⁰. 이 접근법은 생체 내 표현형과의 관련성으로 인해 유용하며 세포 이동 동안 약물 및 화학 유인 물질의 역할을 결정하는 데 효과적이다¹¹. 시간 경과에 따른 세포 갭 거리를 측정함으로써 전체 세포 질량과 개별 세포 모두의 이동 능력을 평가할 수 있다¹¹. 이 원고에서는 신경관을 둘러싼 HA가 풍부한 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 수정된 시험관 내 상처 봉합 기반 분석이 도입되었습니다. 이 절차는 NCC 이동에서 ECM 스캐폴드의 역할을 분석하기 위해 다양한 ECM 구성 요소(즉, 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌)를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

Protocol

모든 시술은 오사카 대학 치과 대학원 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. 마우스 두개골 신경 능선 세포의 배양 참고: 이 연구에 사용된 신경 능선 세포주는 원래 Wnt1-Cre에서 파생된 O9-1 세포로 구성됩니다. E8.5 마우스 배아에서 분리된 R26R-GFP 발현 세포12 (논의 참조). O9-1 세포를 배양하기 위해 여기에 설명?…

Representative Results

여기에 기술된 프로토콜을 사용하여 Col1 및 고분자량 HA(평균 분자량: 1,200-1,400 kDa)로 구성된 혼합 기질 상에서 이동 분석을 수행하였다. 갭의 경계에 있는 O9-1 세포는 HA가 풍부한 갭으로 쉽게 이동하는 것으로 나타났습니다(그림 4). FA 마커인 빈쿨린14에 대한 면역염색을 통해 O9-1 세포가 HA 분해 부위에서 국소 유착(FA)을 형성했음을 확인했습니다(<strong class="…

Discussion

다양한 ECM 구성 요소가 NCC 마이그레이션/마이그레이션을 규제합니다. 예를 들어, HA는 NCC 마이그레이션 ^2,15를 긍정적으로 규제합니다. 흥미롭게도, 세포 표면 히알루로니다아제인 Tmem2의 유전자 마우스 모델을 기반으로 한 연구는 NCC 이동에서 HA 분해의 필요성을 설명했다⁹. 콜라겐은 또한 신경관을 둘러싸고 있는 ECM에 풍부하다<sup class…

Materials

10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C