In vitro Undersökning av effekterna av den hyaluronanrika extracellulära matrisen på neural vapencellmigration
Summary
Detta protokoll beskriver ett in vitro-migrationsexperiment som är lämpligt för funktionell analys av molekylerna som är involverade i in vivo-migrationen av neurala vapenceller till den hyaluronanrika extracellulära matrisen.
Abstract
Neurala vapenceller (NCC) är högvandrande celler som härrör från neuralrörets dorsala region. Utvandringen av NCC från neuralröret är en viktig process för NCC-produktion och deras efterföljande migration mot målplatser. Migrationsvägen för NCC, inklusive de omgivande neuralrörsvävnaderna, involverar hyaluronan (HA) -rik extracellulär matris. För att modellera NCC-migration till dessa HA-rika omgivande vävnader från neuralröret etablerades i denna studie en blandad substratmigrationsanalys bestående av HA (genomsnittlig molekylvikt: 1 200-1 400 kDa) och kollagen typ I (Col1). Denna migrationsanalys visar att NCC-cellinjeceller, O9-1, är högvandrande på det blandade substratet och att HA-beläggningen bryts ned vid platsen för fokala adherenser under migreringsförloppet. Denna in vitro-modell kan vara användbar för vidare utforskning av den mekanistiska grunden som är involverad i NCC-migration. Detta protokoll är också tillämpligt för att utvärdera olika substrat som ställningar för att studera NCC-migration.
Introduction
Neurala vapenceller (NCC) är en multipotent cellpopulation som är närvarande i utvecklande embryon, och de härstammar från neuralplattgränsen under neurulation. De bidrar till bildandet av en mängd olika vävnader, inklusive det perifera nervsystemet, hjärt-kärlsystemet, kraniofaciala vävnader och skelettet1. Efter induktion och NCC-specifikation vid nervplattgränsen emigrerar NCC från neuroepitelet och migrerar mot NCC-härledda vävnadsställen1.
Hyaluronan (HA) är en icke-sulfaterad glykosaminoglykan som distribueras i en mängd olika vävnader som en komponent i den extracellulära matrisen (ECM). Betydelsen av HA i embryoutveckling har visats i modellsystem genom ablation av gener som är ansvariga för hyaluronans metabolism. Till exempel visade sig mutationer i hyaluronansyntasgener (Has1 och Has2) i Xenopus leda till NCC-migrationsdefekter och kraniofacial missbildning2. Dessutom har de HA-bindande proteoglykanerna, aggrecan och versican, rapporterats ha hämmande effekter på NCC-migration3. Hos möss leder Has2-ablation till allvarliga defekter i endokardiell kuddebildning, vilket resulterar i mid-gestation (E9.5-10) dödlighet 4,5,6.
Transmembranprotein 2 (Tmem2), ett hyaluronidas på cellytan, har nyligen visat sig spela en avgörande roll för att främja integrinmedierad adhesion och migration av cancerceller genom att avlägsna matrisassocierad HA vid adhesionsställena 7,8. Mer nyligen har Inubushi et al.9 visat att en brist på Tmem2 leder till allvarliga kraniofaciala defekter på grund av avvikelser i NCC-utvandring/migration och överlevnad. I föregående studie9 analyserades Tmem2-uttryck under NCC-bildning och migration. Tmem2-uttryck observerades vid delamineringen av NCC och vid emigrerande Sox9-positiva NCC (figur 1). Dessutom, med användning av Tmem2-utarmade O9-1-celler från mus, visade studien att in vitro-uttrycket av Tmem2 var avgörande för att O9-1-cellerna skulle bilda fokala adherenser och för deras migration till HA-innehållande substrat (figur 2 och figur 3)9.
Dessa resultat indikerar starkt att Tmem2 också är viktigt för NCC-adhesion och migration genom HA-rik ECM. Den molekylära mekanismen för NCC-adhesion och migration inom HA-rich ECM är dock fortfarande oklar. Det är därför nödvändigt att etablera ett experimentellt system för in vitro-odling för att fullt ut utforska NCC-adhesion och migration inom HA-rik ECM.
Av de många metoder som används vid testning av cellmigration är cellsårstängningsbaserad analys en enkel metod som ofta används inom fysiologi och onkologi10. Detta tillvägagångssätt är användbart på grund av dess relevans för de vivo-fenotypen och är effektivt för att bestämma rollerna för läkemedel och kemoattractants under cellmigration11. Det är möjligt att utvärdera migrationsförmågan hos både helcellsmassor och enskilda celler genom att mäta cellgapavstånden över tid11. I detta manuskript introduceras en modifierad in vitro sårstängningsbaserad analys för att modellera NCC-migration till HA-rika vävnader som omger neuralröret. Denna procedur är också tillämplig för att studera olika ECM-komponenter (dvs. kollagener, fibronektin och laminin) för att analysera ECM-ställningens roll i NCC-migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Olika ECM-komponenter reglerar NCC-utvandring/migrering. Till exempel reglerar HA positivt NCC-migrering 2,15. Intressant nog belyste en studie baserad på genetiska musmodeller av Tmem2, ett hyaluronidas på cellytan, kravet på HA-nedbrytning vid NCC-migration9. Kollagener finns också rikligt i ECM som omger neuralröret16. Dekorin, en liten leucinrik proteoglykan, har visat sig reglera NCC-migration under neural…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jag uttrycker stort erkännande till Fumitoshi Irie och Yu Yamaguchi för deras uppmuntran och vänliga förslag för att etablera denna metod. Detta arbete stöddes av bidrag till vetenskapliga forskningsprogram från Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 till TI, #20H03896 till TI). Den ursprungliga metoden för beläggning av HA på glassubstrat och in situ HA-nedbrytningsanalyser på substraten beskrevs i Yamamoto et al. (2017) 8, medan metoden för beredning av HA/Col1 blandade substrat beskrevs i Irie et al. (2021) 7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
Referências
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Biologia do Desenvolvimento. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
