Manipulation CRISPR ciblée placentaire in vivo chez la souris
Summary
Nous décrivons ici une méthode spécifique au temps pour manipuler efficacement les voies de développement critiques dans le placenta de la souris in vivo. Ceci est réalisé par injection et électroporation de plasmides CRISPR dans les placentas des mères gravides au jour embryonnaire 12.5.
Abstract
Le placenta est un organe essentiel qui régule et maintient le développement des mammifères in utero. Le placenta est responsable du transfert des nutriments et des déchets entre la mère et le fœtus et de la production et de l’administration des facteurs de croissance et des hormones. Les manipulations génétiques placentaires chez la souris sont essentielles pour comprendre le rôle spécifique du placenta dans le développement prénatal. Les souris transgéniques exprimant Cre spécifiques au placental ont une efficacité variable, et d’autres méthodes de manipulation du gène placentaire peuvent être des alternatives utiles. Cet article décrit une technique pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation du gène CRISPR, qui peut être utilisée pour modifier l’expression des gènes ciblés. En utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, les mères enceintes subissent une laparotomie au jour embryonnaire 12.5 (E12.5), et un plasmide CRISPR est délivré par une micropipette en verre dans les placentas individuels. Le plasmide est immédiatement électroporé après chaque injection. Après la récupération de la mère, les placentas et les embryons peuvent continuer à se développer jusqu’à une évaluation ultérieure. L’évaluation du placenta et de la progéniture après l’utilisation de cette technique peut déterminer le rôle de la fonction placentaire spécifique au temps dans le développement. Ce type de manipulation permettra de mieux comprendre l’impact de la génétique et de la fonction placentaires sur la croissance et le développement du fœtus dans de multiples contextes de maladies.
Introduction
Le placenta est un organe essentiel impliqué dans le développement du fœtus. Le rôle principal du placenta est de fournir des facteurs essentiels et de réguler le transfert des nutriments et des déchets vers et depuis le fœtus. Les placentas des mammifères sont composés à la fois de tissus fœtaux et maternels, qui constituent l’interface fœtale-maternelle et, par conséquent, la génétique de la mère et du fœtus a un impact sur la fonction1. Des anomalies génétiques ou une altération de la fonction du placenta peuvent modifier considérablement le développement du fœtus. Des travaux antérieurs ont montré que la génétique placentaire et le développement sont associés au développement altéré de systèmes d’organes spécifiques chez le fœtus. En particulier, les anomalies du placenta sont liées à des changements dans le cerveau, le cœur et le système vasculairedu fœtus 2,3,4,5.
Le transport des hormones, des facteurs de croissance et d’autres molécules du placenta au fœtus joue un rôle majeur dans le développement du fœtus6. Il a été démontré que la modification de la production placentaire de molécules spécifiques peut altérer le développement neurologique. L’inflammation maternelle peut augmenter la production de sérotonine en modifiant l’expression métabolique du gène du tryptophane (TRP) dans le placenta, ce qui crée par la suite une accumulation de sérotonine dans le cerveau du fœtus7. D’autres études ont trouvé des anomalies placentaires ainsi que des malformations cardiaques. On pense que les anomalies du placenta contribuent aux malformations cardiaques congénitales, l’anomalie congénitale la plus fréquente chez l’homme8. Une étude récente a identifié plusieurs gènes qui ont des voies cellulaires similaires dans le placenta et le cœur. Si elles sont perturbées, ces voies pourraient causer des défauts dans les deux organes9. Les défauts du placenta peuvent exacerber les malformations cardiaques congénitales. Le rôle de la génétique placentaire et de sa fonction sur le développement d’organes fœtaux spécifiques est un domaine d’étude émergent.
Les souris ont des placentas hémochoraux et d’autres caractéristiques des placentas humains, ce qui en fait des modèles très utiles pour étudier les maladies humaines1. Malgré l’importance du placenta, il y a actuellement un manque de manipulations génétiques in vivo ciblées. En outre, il existe actuellement plus d’options disponibles pour les knockouts ou knockdowns que les manipulations de surexpression ou de gain de fonction dans le placenta10. Il existe plusieurs lignées transgéniques exprimant Cre pour la manipulation spécifique du placentaire, chacune dans différentes lignées trophoblastiques à différents moments de temps. Il s’agit notamment du Cyp19-Cre, de l’Ada/Tpbpa-Cre, du PDGFRα-Creer et du Gcm1-Cre11,12,13,14. Bien que ces transgènes Cre soient efficaces, ils peuvent ne pas être capables de manipuler certains gènes à des moments spécifiques. Une autre méthode couramment utilisée pour éliminer ou surexprimer l’expression des gènes placentaires est l’insertion de vecteurs lentiviraux dans la culture de blastocystes, ce qui provoque une manipulation génétique spécifique au trophoblaste15,16. Cette technique permet un changement robuste dans l’expression du gène placentaire au début du développement. L’utilisation de l’interférence ARN in vivo a été peu utilisée dans le placenta. L’insertion de plasmides shRNA peut être réalisée de manière similaire à la technique CRIPSR décrite dans cet article. Cela a été fait à E13.5 pour diminuer avec succès l’expression de PlGF dans le placenta, avec des impacts sur le système vasculaire cérébral de la progéniture17.
En plus des techniques qui sont principalement utilisées pour knockout ou knockdown, induire une surexpression est couramment réalisée avec des adénovirus ou l’insertion d’une protéine exogène. Les techniques utilisées pour la surexpression ont des taux de réussite variables et ont pour la plupart été effectuées plus tard dans la gestation. Pour étudier le rôle du facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1) dans la fonction placentaire, un transfert de gène placentaire médié par l’adénovira a été effectué pour induire la surexpression du gène IGF-1 18,19. Cela a été réalisé tard dans la gestation de la souris sur E18.5 par injection placentaire directe. Pour fournir des options supplémentaires et contourner les échecs possibles des manipulations génétiques placentaires établies, telles que les échecs de la combinaison Cre-Lox, la toxicité possible des adénovirus et les effets hors cible de shRNA, la manipulation directe CRISPR in vivo du placenta peut être utilisée20,21,22. Ce modèle a été développé pour remédier au manque de modèles de surexpression et pour créer un modèle flexible.
Cette technique est basée sur les travaux de Lecuyer et al., dans lesquels les plasmides shRNA et CRISPR ont été ciblés directement in vivo sur les placentas de souris pour modifier l’expression de PlGF 17. Cette technique peut être utilisée pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation CRISPR à plusieurs points temporels; pour ce travail, E12.5 a été sélectionné. Le placenta a mûri à ce stade et est assez grand pour être manipulé, ce qui permet l’insertion d’un plasmide CRISPR spécifique sur E12.5, ce qui peut avoir un impact significatif sur le développement du fœtus du milieu à la fin de la grossesse23,24. Contrairement aux approches transgéniques, mais similaires aux inductions virales ou aux interférences ARN, cette technique permet une surexpression ou un knockout à des moments particuliers en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, évitant ainsi une éventuelle altération de la placentation ou de la létalité embryonnaire due à des changements antérieurs. Comme seuls quelques placentas reçoivent le plasmide expérimental ou témoin dans une portée, l’approche permet deux types de contrôles internes. Ces témoins sont ceux qui sont injectés et électroporés avec le plasmide de contrôle approprié et ceux qui ne reçoivent aucune manipulation directe. Cette technique a été optimisée pour créer une surexpression du gène IGF-1 dans le placenta de souris via un plasmide CRISPR médiateur d’activation synergique (SAM). Le gène IGF-1 a été choisi, car l’IGF-1 est une hormone de croissance essentielle délivrée au fœtus qui est principalement produite dans le placenta avant la naissance25,26. Cette nouvelle technique CRISPR ciblant le placental permettra une manipulation directe pour aider à définir le lien entre la fonction placentaire et le développement fœtal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le placenta est un régulateur primaire de la croissance fœtale et, comme indiqué précédemment, les changements dans l’expression ou la fonction des gènes placentaires peuvent avoir un impact significatif sur le développement du fœtus6. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour effectuer une manipulation CRISPR in vivo ciblée du placenta de souris en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée. Cette technique permet un rendement significatif d’embryons v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent les sources de financement suivantes : R01 MH122435, NIH T32GM008629 et NIH T32GM145441. Les auteurs remercient les laboratoires du Dr Val Sheffield et du Dr Calvin Carter à l’Université de l’Iowa pour l’utilisation de leur salle d’opération et de leur équipement, ainsi que le Dr Eric Van Otterloo, le Dr Nandakumar Narayanan et le Dr Matthew Weber pour leur aide en microscopie. Les auteurs remercient également la Dre Sara Maurer, Maya Evans et Sreelekha Kundu pour leur aide dans les chirurgies pilotes.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
Referências
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