Bepaling van thermische limieten voor zoöplankton met behulp van een warmteblok
Summary
Het huidige protocol illustreert het gebruik van commercieel verkrijgbare componenten om een stabiele en lineaire thermische gradiënt te genereren. Een dergelijke gradiënt kan vervolgens worden gebruikt om de bovenste thermische limiet van planktonische organismen te bepalen, met name ongewervelde larven.
Abstract
Thermische limieten en breedte zijn op grote schaal gebruikt om de verspreiding van soorten te voorspellen. Naarmate de wereldwijde temperatuur blijft stijgen, is het van vitaal belang om te begrijpen hoe thermische limieten veranderen met acclimatisatie en hoe deze varieert tussen levensfasen en populaties om de kwetsbaarheid van soorten voor toekomstige opwarming te bepalen. De meeste mariene organismen hebben complexe levenscycli die vroege planktonische stadia omvatten. Hoewel het kwantificeren van de thermische limiet van deze kleine vroege ontwikkelingsstadia (tientallen tot honderden micron) helpt bij het identificeren van ontwikkelingsknelpunten, kan dit proces een uitdaging zijn vanwege de kleine omvang van doelorganismen, de behoefte aan grote bankruimte en de hoge initiële fabricagekosten. Hier wordt een opstelling gepresenteerd die is gericht op kleine volumes (ml tot tientallen ml). Deze opstelling combineert commercieel verkrijgbare componenten om een stabiele en lineaire thermische gradiënt te genereren. Productiespecificaties van de opstelling, evenals procedures om levende versus dode individuen te introduceren en op te sommen en de dodelijke temperatuur te berekenen, worden ook gepresenteerd.
Introduction
Thermische tolerantie is de sleutel tot de overleving en functie van organismen 1,2. Naarmate de planeet blijft opwarmen als gevolg van antropogene koolstofemissies, wordt er steeds meer aandacht besteed aan het bepalen en toepassen van thermische limieten3. Verschillende eindpunten, zoals mortaliteit, niet-ontwikkeling en verlies van mobiliteit, zijn gebruikt om zowel de bovenste als de onderste thermische limieten te bepalen4. Deze thermische limieten worden vaak beschouwd als een proxy voor de thermische niche van een organisme. Deze informatie wordt op zijn beurt gebruikt om soorten te identificeren die kwetsbaarder zijn voor het broeikaseffect, en om toekomstige soortendistributie en de resulterende soortinteracties te voorspellen 3,5,6,7. Het bepalen van thermische limieten, vooral voor kleine planktonorganismen, kan echter een uitdaging zijn.
Voor planktonorganismen, met name de larvale stadia van ongewervelde zeedieren, kan de thermische limiet worden bepaald door chronische blootstelling. Chronische blootstelling wordt bereikt door larven op verschillende temperaturen gedurende dagen tot weken op te voeden en de temperatuur te bepalen waarbij de overlevings- en/of ontwikkelingssnelheid van larven 8,9,10 vermindert. Deze aanpak is echter nogal tijdrovend en vereist grote incubators en ervaring in de veehouderij van larven (zie referentie11 voor een goede inleiding tot het kweken van mariene ongewervelde larven).
Als alternatief kan acute blootstelling aan thermische stress worden gebruikt om thermische limieten te bepalen. Vaak omvat deze bepalingsbenadering het plaatsen van kleine injectieflacons met larven in temperatuurgecontroleerde droge baden 12,13,14, het gebruik van thermische gradiëntfuncties in PCR thermische cyclers15,16, of het plaatsen van glazen injectieflacons / microcentrifugebuizen langs een thermische gradiënt die wordt gegenereerd door toegepaste verwarming en koeling aan de uiteinden van grote aluminium blokken met gaten waarin de injectieflacons knuspassen 17, 18,19. Typische droge baden genereren een enkele temperatuur; daarom moeten meerdere eenheden tegelijkertijd worden gebruikt om de prestaties over een temperatuurbereik te beoordelen. Thermische cyclers genereren een gradiënt, maar bieden slechts plaats aan een klein monstervolume (120 μL) en vereisen zorgvuldige manipulaties. Net als thermische cyclers creëren grote aluminium blokken lineaire en stabiele temperatuurgradiënten. Beide benaderingen kunnen worden gekoppeld aan logistische of probit-regressie om de dodelijke temperatuur voor 50% procent van de bevolking te berekenen (LT50) 12,20,21. De gebruikte aluminium blokken waren echter ~ 100 cm lang; deze grootte vereist een grote laboratoriumruimte en toegang tot gespecialiseerde computer numerieke besturingsmachines om de gaten te boren. Samen met het gebruik van twee waterbaden van onderzoekskwaliteit om de doeltemperatuur te handhaven, zijn de financiële kosten van het monteren van de opstelling hoog.
Daarom is dit werk gericht op het ontwikkelen van een alternatief middel om een stabiele, lineaire temperatuurgradiënt te genereren met in de handel verkrijgbare onderdelen. Een dergelijk product moet een kleine voetafdruk hebben en moet gemakkelijk kunnen worden gebruikt voor experimenten met acute thermische stressblootstelling voor planktonische organismen. Dit protocol is ontwikkeld met zoöplankton dat <1 mm groot is als doelorganismen, en dus is het geoptimaliseerd voor het gebruik van een microcentrifugebuis van 1,5 of 2 ml. Grotere onderzoeksorganismen vereisen containers die groter zijn dan de gebruikte 1,5 ml microcentrifugebuizen en vergrote gaten in de aluminiumblokken.
Naast het toegankelijker maken van het experimentele apparaat, heeft dit werk tot doel de pijplijn voor gegevensverwerking te vereenvoudigen. Hoewel commerciële statistische software routines biedt om LT50 te berekenen met behulp van logistische of probit-regressie, zijn de licentiekosten niet triviaal. Daarom zou een eenvoudig te gebruiken script dat afhankelijk is van het open-source statistische programma R22 data-analyse toegankelijker maken.
Dit protocol laat zien hoe een compact warmteblok kan worden vervaardigd met in de handel verkrijgbare onderdelen en kan worden toegepast op het blootstellen van zoöplankton (larven van de zanddollar Dendraster excentricus) aan acute hittestress om hun bovenste thermische limiet te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een toegankelijke en aanpasbare aanpak om de thermische limieten van kleine planktonorganismen te bepalen door acute thermische blootstelling. Het 10-gats ontwerp en de flexibele temperatuureindpunten, geregeld door het waterbad aan de onderkant en de verwarming aan de bovenkant, stellen het mogelijk om LT50 met precisie te bepalen. Met deze aanpak kon een verschil in de thermische limiet van <1 °C worden gedetecteerd (figuur 3). Deze aanpak biedt een snelle be…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door het Faculty Research Fund van het Swarthmore College [KC] en de Robert Reynolds and Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship voor BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
Referências
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
