Bestimmung der thermischen Grenzen für Zooplankton mit einem Wärmeblock
Summary
Das vorliegende Protokoll veranschaulicht die Verwendung kommerziell erhältlicher Komponenten zur Erzeugung eines stabilen und linearen thermischen Gradienten. Ein solcher Gradient kann dann verwendet werden, um die obere thermische Grenze von Planktonorganismen, insbesondere wirbellosen Larven, zu bestimmen.
Abstract
Thermische Grenzen und Breite wurden häufig verwendet, um die Verbreitung von Arten vorherzusagen. Da die globale Temperatur weiter steigt, ist es wichtig zu verstehen, wie sich die thermische Grenze mit der Akklimatisierung ändert und wie sie zwischen Lebensstadien und Populationen variiert, um die Anfälligkeit von Arten für zukünftige Erwärmung zu bestimmen. Die meisten Meeresorganismen haben komplexe Lebenszyklen, die frühe planktonische Stadien umfassen. Während die Quantifizierung der thermischen Grenze dieser kleinen frühen Entwicklungsstadien (Dutzende bis Hunderte von Mikrometern) hilft, Entwicklungsengpässe zu identifizieren, kann dieser Prozess aufgrund der geringen Größe der Zielorganismen, des großen Platzbedarfs auf der Bank und der hohen anfänglichen Herstellungskosten eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Aufbau vorgestellt, der auf kleine Volumina (ml bis zehn ml) ausgerichtet ist. Dieser Aufbau kombiniert handelsübliche Komponenten, um einen stabilen und linearen thermischen Gradienten zu erzeugen. Produktionsspezifikationen des Aufbaus sowie Verfahren zur Einführung und Zählung lebender und toter Individuen und zur Berechnung der tödlichen Temperatur werden ebenfalls vorgestellt.
Introduction
Die thermische Toleranz ist der Schlüssel zum Überleben und zur Funktion von Organismen 1,2. Da sich der Planet aufgrund anthropogener Kohlenstoffemissionen weiter erwärmt, wird der Bestimmung und Anwendung thermischer Grenzwerte zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt3. Verschiedene Endpunkte wie Mortalität, Entwicklungsstörungen und Mobilitätsverlust wurden verwendet, um sowohl die oberen als auch die unteren thermischen Grenzen zu bestimmen4. Diese thermischen Grenzen werden oft als Proxy für die thermische Nische eines Organismus angesehen. Diese Informationen werden wiederum verwendet, um Arten zu identifizieren, die anfälliger für die globale Erwärmung sind, sowie die zukünftige Artenverteilung und die daraus resultierenden Arteninteraktionenvorherzusagen 3,5,6,7. Die Bestimmung thermischer Grenzen, insbesondere für kleine planktonische Organismen, kann jedoch eine Herausforderung darstellen.
Für planktonische Organismen, insbesondere die Larvenstadien mariner Wirbelloser, kann die thermische Grenze durch chronische Exposition bestimmt werden. Chronische Exposition wird erreicht, indem Larven bei mehreren Temperaturen über Tage bis Wochen aufgezogen werden und die Temperatur bestimmt wird, bei der das Überleben und/oder die Entwicklungsrate der Larven abnimmt 8,9,10. Dieser Ansatz ist jedoch ziemlich zeitaufwendig und erfordert große Inkubatoren und Erfahrung in der Larvenzucht (siehe Referenz11 für eine gute Einführung in die Kultivierung mariner wirbelloser Larven).
Alternativ kann die akute Exposition gegenüber thermischer Belastung zur Bestimmung thermischer Grenzen verwendet werden. Häufig beinhaltet dieser Bestimmungsansatz die Platzierung kleiner Fläschchen mit Larven in temperaturgesteuerten Trockenbädern 12,13,14, die Nutzung thermischer Gradientenfunktionen in PCR-Thermocyclern15,16 oder das Aufstellen von Glasfläschchen/Mikrozentrifugenröhrchen entlang eines thermischen Gradienten, der durch Erhitzen und Abkühlen an den Enden großer Aluminiumblöcke mit Löchern erzeugt wird, in die die Fläschchen eng passen 17, 18,19. Typische Trockenbäder erzeugen eine einzige Temperatur; Daher müssen mehrere Einheiten gleichzeitig betrieben werden, um die Leistung über einen Temperaturbereich zu bewerten. Thermocycler erzeugen einen Gradienten, nehmen aber nur ein kleines Probenvolumen (120 μL) auf und erfordern sorgfältige Manipulationen. Ähnlich wie Thermocycler erzeugen große Aluminiumblöcke lineare und stabile Temperaturgradienten. Beide Ansätze können mit logistischer oder Probit-Regression gekoppelt werden, um die tödliche Temperatur für 50% Prozent der Bevölkerung zu berechnen (LT50)12,20,21. Die verwendeten Aluminiumblöcke waren jedoch ~100 cm lang; Diese Größe erfordert einen großen Laborraum und Zugang zu spezialisierten numerisch gesteuerten Fräsmaschinen zur Bohrung der Löcher. Zusammen mit der Verwendung von zwei Wasserbädern in Forschungsqualität zur Aufrechterhaltung der Zieltemperatur sind die finanziellen Kosten für die Montage des Setups hoch.
Daher zielt diese Arbeit darauf ab, ein alternatives Mittel zur Erzeugung eines stabilen, linearen Temperaturgradienten mit kommerziell erhältlichen Teilen zu entwickeln. Ein solches Produkt muss einen geringen Platzbedarf haben und sollte leicht für Experimente zur akuten thermischen Stressexposition von Planktonorganismen verwendet werden können. Dieses Protokoll wurde mit Zooplankton entwickelt, das als Zielorganismen <1 mm groß ist, und wurde daher für die Verwendung eines 1,5- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens optimiert. Größere Studienorganismen benötigen Behälter, die größer sind als die verwendeten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und vergrößerte Löcher in den Aluminiumblöcken.
Neben der Verbesserung des Zugangs zu den experimentellen Geräten zielt diese Arbeit darauf ab, die Datenverarbeitungspipeline zu vereinfachen. Während kommerzielle Statistiksoftware Routinen zur Berechnung von LT50 mittels logistischer oder Probit-Regression bereitstellt, sind die Lizenzkosten nicht trivial. Daher würde ein einfach zu bedienendes Skript, das auf dem Open-Source-Statistikprogramm R22 basiert, die Datenanalyse zugänglicher machen.
Dieses Protokoll zeigt, wie ein kompakter Wärmeblock mit handelsüblichen Teilen hergestellt und angewendet werden kann, um Zooplankton (Larven des Sanddollars Dendraster excentricus) akutem Hitzestress auszusetzen, um seine obere thermische Grenze zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet einen zugänglichen und anpassbaren Ansatz zur Bestimmung der thermischen Grenzen von kleinen Planktonorganismen durch akute thermische Exposition. Das 10-Loch-Design und die flexiblen Temperaturendpunkte, die durch das Wasserbad am unteren Ende und die Heizung am oberen Ende gesteuert werden, ermöglichen eine präzise Bestimmung des LT50. Mit diesem Ansatz konnte ein Unterschied in der thermischen Grenze von <1 °C festgestellt werden (Abbildung 3). Diese…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird vom Faculty Research Fund des Swarthmore College [KC] und dem Robert Reynolds und Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship für BJ unterstützt.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
Referências
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