Determinação de limites térmicos para zooplâncton usando um bloco de calor
Summary
O presente protocolo ilustra o uso de componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. Tal gradiente pode então ser usado para determinar o limite térmico superior de organismos planctônicos, particularmente larvas de invertebrados.
Abstract
Limites térmicos e amplitude têm sido amplamente utilizados para prever a distribuição de espécies. À medida que a temperatura global continua a subir, entender como o limite térmico muda com a aclimatação e como ele varia entre os estágios da vida e as populações é vital para determinar a vulnerabilidade das espécies ao aquecimento futuro. A maioria dos organismos marinhos tem ciclos de vida complexos que incluem estágios planctônicos iniciais. Embora quantificar o limite térmico desses pequenos estágios iniciais de desenvolvimento (dezenas a centenas de mícrons) ajude a identificar gargalos de desenvolvimento, esse processo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho dos organismos-alvo, à grande necessidade de espaço de bancada e ao alto custo inicial de fabricação. Aqui, uma configuração voltada para pequenos volumes (mL a dezenas de mL) é apresentada. Esta configuração combina componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. As especificações de produção da configuração, bem como os procedimentos para introduzir e enumerar indivíduos vivos versus mortos e calcular a temperatura letal, também são apresentados.
Introduction
A tolerância térmica é fundamental para a sobrevivência e função dos organismos 1,2. À medida que o planeta continua a aquecer devido às emissões antropogénicas de carbono, está a ser dada cada vez mais atenção à determinação e aplicação de limites térmicos3. Vários desfechos, como mortalidade, falha no desenvolvimento e perda de mobilidade, têm sido utilizados para determinar os limites térmicos superiores e inferiores4. Esses limites térmicos são frequentemente considerados um proxy para o nicho térmico de um organismo. Essas informações, por sua vez, são utilizadas para identificar espécies mais vulneráveis ao aquecimento global, bem como prever a distribuição futura de espécies e as interações resultantes das espécies 3,5,6,7. No entanto, determinar limites térmicos, especialmente para pequenos organismos planctônicos, pode ser um desafio.
Para organismos planctônicos, particularmente os estágios larvais de invertebrados marinhos, o limite térmico pode ser determinado através da exposição crônica. A exposição crônica é alcançada pela criação de larvas a várias temperaturas ao longo de dias a semanas e pela determinação da temperatura na qual a sobrevivência larval e/ou a taxa de desenvolvimento reduzem 8,9,10. No entanto, esta abordagem é bastante demorada e requer grandes incubadoras e experiência na criação de larvas (ver referência11 para uma boa introdução à cultura de larvas de invertebrados marinhos).
Alternativamente, a exposição aguda ao estresse térmico pode ser usada para determinar os limites térmicos. Muitas vezes, essa abordagem de determinação envolve a colocação de pequenos frascos com larvas em banhos secos com temperatura controlada 12,13,14, alavancando funções de gradiente térmico em termocicladores de PCR 15,16 ou colocando frascos de vidro/tubos de microcentrífuga ao longo de um gradiente térmico gerado pelo aquecimento e resfriamento aplicados nas extremidades de grandes blocos de alumínio com orifícios nos quais os frascos se encaixam confortavelmente 17, 18,19. Banhos secos típicos geram uma única temperatura; portanto, várias unidades devem ser operadas simultaneamente para avaliar o desempenho em uma faixa de temperaturas. Os termocicladores geram um gradiente, mas acomodam apenas um pequeno volume de amostra (120 μL) e requerem manipulações cuidadosas. Semelhante aos termocicladores, grandes blocos de alumínio criam gradientes de temperatura lineares e estáveis. Ambas as abordagens podem ser acopladas à regressão logística ou probit para calcular a temperatura letal para 50% por cento da população (LT50)12,20,21. No entanto, os blocos de alumínio utilizados tinham ~ 100 cm de comprimento; esse tamanho demanda um grande espaço de laboratório e acesso a fresadoras especializadas em controle numérico por computador para perfurar os furos. Juntamente com o uso de dois banhos de água de grau de pesquisa para manter a temperatura alvo, o custo financeiro de montagem da configuração é alto.
Portanto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um meio alternativo para gerar um gradiente de temperatura estável e linear com peças comercialmente disponíveis. Tal produto deve ter uma pegada pequena e deve ser capaz de ser facilmente utilizado para experiências de exposição ao stress térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo é desenvolvido com zooplâncton que tem <1 mm de tamanho como organismos-alvo e, assim, foi otimizado para o uso de um tubo microcentrífugo de 1,5 ou 2 mL. Organismos de estudo maiores exigirão recipientes maiores do que os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usados e furos ampliados nos blocos de alumínio.
Além de tornar o aparato experimental mais acessível, este trabalho visa simplificar o pipeline de processamento de dados. Embora o software estatístico comercial forneça rotinas para calcular o LT50 usando regressão logística ou probit, o custo de licenciamento não é trivial. Portanto, um script fácil de usar que se baseia no programa estatístico de código aberto R22 tornaria a análise de dados mais acessível.
Este protocolo mostra como um bloco de calor compacto pode ser fabricado com peças comercialmente disponíveis e ser aplicado para expor o zooplâncton (larvas do Dendraster excentricus) ao estresse térmico agudo para determinar seu limite térmico superior.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece uma abordagem acessível e personalizável para determinar os limites térmicos de pequenos organismos de plâncton através da exposição térmica aguda. O design de 10 furos e os endpoints de temperatura flexíveis, controlados pelo banho-maria na extremidade inferior e pelo aquecedor na extremidade superior, permitem determinar o LT50 com precisão. Usando essa abordagem, uma diferença no limite térmico que é de <1 °C pôde ser detectada (Figura 3). …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Faculdade do Swarthmore College [KC] e pela Robert Reynolds e Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship para BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
Referências
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
