研究卵巢切除小鼠模型中子宫对妊娠建立的贡献的方法
Summary
怀孕的建立是一个动态的过程，涉及复杂的胚胎和子宫串扰。母体子宫环境对这些过程的确切贡献仍然是一个活跃的研究领域。在这里，提供了详细的协议来帮助设计 体内 动物模型来解决这些研究问题。
Abstract
为了确定怀孕，一个可行的囊胚必须成功地与接受性子宫内膜（子宫内膜）相互作用，以促进植入和胎盘形成，并使持续妊娠成为可能。胚胎缺陷引起的妊娠成功的局限性是众所周知的，并且随着 体外 受精（IVF）和辅助生殖技术的兴起，近几十年来已在很大程度上克服了这些限制。然而，到目前为止，该领域尚未克服子宫内膜接受不足造成的限制，从而导致试管婴儿成功率停滞不前。卵巢和子宫内膜功能紧密交织在一起，因为卵巢产生的激素负责子宫内膜的月经周期性。因此，当使用啮齿动物怀孕模型时，很难确定观察到的结果是由于卵巢或子宫缺陷。为了克服这个问题，开发了一种具有胚胎移植或人工蜕膜化的卵巢切除小鼠模型，以允许研究子宫对怀孕的特异性贡献。本文将提供有关如何进行卵巢切除术的说明，并提供有关提供外源性激素的各种技术的见解，以支持健康供体胚胎移植后成功的人工蜕膜化或怀孕。这些技术包括皮下注射、缓释微丸和渗透微型泵。将讨论每种方法的主要优点和缺点，使研究人员能够为其特定的研究问题选择最佳的研究设计。
Introduction
近几十年来，随着辅助生殖技术的使用越来越多，许多受孕障碍已被克服，尽管存在生育问题，但仍允许许多夫妇组建家庭1。卵母细胞或精子缺陷通常可以通过 体外 受精或卵胞浆内单精子注射来绕过;然而，与子宫和子宫内膜容受性有关的问题仍然是生殖潜力难以捉摸的“黑匣子”2。
当高质量的胚胎成功地与感受性子宫内膜（子宫内膜）相互作用时，就建立了怀孕。在任何给定的月经周期中成功怀孕的机会都很低，约为 30%3，4。在成功的妊娠中，只有50%-60%的人在妊娠20周后提前，植入失败是75%未达到20周的妊娠的原因3。尽管这些数字可以追溯到1990年代后期，但该领域尚未克服子宫内膜接受能力不足造成的限制。这导致近年来试管婴儿成功率停滞不前 – 有时甚至下降 – 5，6。
患有不明原因不孕症的女性通常有一个移位的接受窗口，或者由于未知原因无法实现接受。最近，开发了子宫内膜容受性阵列，该阵列评估了数百个基因的表达，目的是根据个体的接受性窗口调整胚胎移植的时间7，8，9。然而，该领域仍然缺乏对植入过程完成后出现的妊娠并发症的发病机制的理解。
女性生殖系统是高度动态的，并受到严格的荷尔蒙控制。下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴控制黄体生成素和卵泡刺激素的释放，它们调节卵巢周期的各个方面，包括卵泡成熟以及雌激素和孕激素活性。反过来，子宫月经周期由雌激素和黄体酮10，11调节。因此，研究子宫生物学机制因卵巢的影响而变得复杂。例如，在研究癌症疗法如何影响子宫时，很难区分观察到的任何子宫表型（例如妊娠丢失或月经不合时宜）是对子宫的直接侮辱还是卵巢损伤的间接影响。
为了全面了解生育能力，必须表征子宫对怀孕的贡献。重要的是，这种理解必须超越卵巢控制下的子宫功能。这不能在人类身上研究;因此，经常使用动物模型。因此，卵巢切除术（OVX）通常用于使研究人员能够通过外源性提供激素来调节啮齿动物发情周期（类似于月经周期）。此外，OVX允许独立于卵巢影响12研究子宫反应。然而，如果在OVX后没有立即提供激素，就会出现更年期表型，这需要研究人员仔细考虑。
OVX经常用于啮齿动物模型13，14，15，16，17，并且在经过充分训练后相对容易执行。方法取决于是单独切除卵巢还是切除卵巢和输卵管，以及动物的年龄（成年，循环动物的卵巢较大，表面有可见的黄体，这意味着它们的卵巢更容易可视化）。同样，存在许多激素补充方法，包括皮下注射14，缓释微丸15，渗透压微型泵18和卵巢移植。
在本文中，提供了有关如何进行卵巢切除术和准备三种激素补充剂的详细说明，包括皮下注射、缓释丸和渗透迷你泵。为受益于OVX的实验终点提供了两种详细的方案，然后是外源性激素补充（胚胎移植和人工蜕膜化）。本文讨论了每种方法的优缺点，目的是指导研究人员如何进行研究以隔离对子宫的影响，特别是在怀孕和生育研究领域。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提供了有关如何进行 OVX 的分步说明，并为专注于了解子宫对怀孕和生育能力的贡献的研究提供外源性激素。在这些方法的两个实验应用中提供了两个详细的方案，包括进行胚胎移植和人工诱导蜕膜化。
虽然最初执行OVX可能具有挑战性 – 特别是对于刚接触啮齿动物模型的研究人员 – 但一旦经过适当的训练和实践，这是一个相对简单的过程。手术中的关键步骤包括在麻醉下…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是通过维多利亚州政府运营基础设施支持和澳大利亚政府国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）IRIISS实现的。这项工作得到了莫纳什大学医学，护理和健康科学平台访问补助金的支持，以访问A.L.W.（WINSHIP-PAG18-0343）以访问莫纳什生殖服务平台。A.L.W. 得到了澳大利亚研究理事会 （ARC） 的 DECRA 资助 DE21010037 的支持。J.N.H.和L.R.A.由澳大利亚政府研究培训计划奖学金支持。L.R.A.由莫纳什研究生卓越奖学金支持。K.J.H.由ARC未来奖学金FT190100265支持。
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
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