Graviditetsetablering er en dynamisk proces, der involverer kompleks embryo- og livmoderkrydstale. De præcise bidrag fra moderens livmodermiljø til disse processer forbliver et aktivt undersøgelsesområde. Her leveres detaljerede protokoller for at hjælpe med at designe in vivo dyremodeller til at løse disse forskningsspørgsmål.
For at graviditet kan etableres, skal en levedygtig blastocyst med succes interagere med en modtagelig livmoderforing (endometrium) for at lette implantation og placenta dannelse og muliggøre igangværende graviditet. Begrænsningerne for graviditetssucces forårsaget af embryonale defekter er velkendte og er stort set blevet overvundet i de seneste årtier med stigningen i in vitro-befrugtning (IVF) og assisteret reproduktionsteknologi. Indtil videre har feltet imidlertid ikke overvundet begrænsningerne forårsaget af et utilstrækkeligt modtageligt endometrium, hvilket resulterer i stagnerende IVF-succesrater. Ovarie- og endometriefunktioner er tæt sammenflettet, da hormoner produceret af æggestokken er ansvarlige for endometriums menstruationscyklus. Som sådan, når du bruger gnavermodeller af graviditet, kan det være svært at fastslå, om et observeret resultat skyldes en ovarie eller livmoderunderskud. For at overvinde dette blev der udviklet en ovariectomized musemodel med embryooverførsel eller kunstig decidualisering for at muliggøre undersøgelse af livmoderspecifikke bidrag til graviditet. Denne artikel vil give instruktioner om, hvordan man udfører ovariektomi og give indsigt i forskellige teknikker til levering af eksogene hormoner til støtte for vellykket kunstig decidualisering eller graviditet efter embryooverførsel fra raske donorer. Disse teknikker omfatter subkutan injektion, pellets med langsom frigivelse og osmotiske minipumper. De vigtigste fordele og ulemper ved hver metode vil blive diskuteret, så forskere kan vælge det bedste undersøgelsesdesign til deres specifikke forskningsspørgsmål.
Med den stigende brug af assisteret reproduktionsteknologi i de seneste årtier er mange barrierer for undfangelse blevet overvundet, hvilket gør det muligt for mange par at starte familier på trods af fertilitetsproblemer1. Oocyt- eller sædunderskud kan ofte omgås ved hjælp af in vitro-befrugtning eller intracytoplasmatisk sædinjektion; Imidlertid forbliver problemer relateret til livmoderen og endometriemodtagelighed en undvigende “sort boks” af reproduktionspotentiale2.
Graviditet etableres, når et embryo af høj kvalitet med succes interagerer med et modtageligt endometrium (livmoderforing). Chancerne for vellykket graviditet i en given menstruationscyklus er lave, omkring 30%3,4. Af dem, der er vellykkede, går kun 50% -60% forbi 20 ugers svangerskab, hvor implantationssvigt er ansvarlig for 75% af graviditeter, der ikke når 20 uger3. På trods af disse tal, der går tilbage til slutningen af 1990’erne, er feltet endnu ikke overvundet begrænsningerne forårsaget af et utilstrækkeligt modtageligt endometrium. Dette har resulteret i stagnerende – og undertiden faldende – IVF-succesrater i de senere år 5,6.
Kvinder med uforklarlig infertilitet har ofte et forskudt vindue af modtagelighed eller er ude af stand til at opnå modtagelighed af ukendte årsager. For nylig blev endometriemodtagelighedsarrayet udviklet, som vurderer ekspressionen af hundredvis af gener med det formål at skræddersy tidspunktet for embryooverførsel til en persons vindue af modtagelighed 7,8,9. Imidlertid mangler feltet stadig en forståelse af patogenesen af graviditetskomplikationer, der manifesterer sig efter implantationsprocessen er afsluttet.
Det kvindelige reproduktive system er meget dynamisk og under stram hormonel kontrol. Hypothalamus-hypofyse-gonadal (HPG) akse styrer frigivelsen af luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon, som regulerer aspekter af æggestokkens cyklus, herunder follikelmodning og østrogen- og progesteronaktivitet. Til gengæld reguleres livmoderens menstruationscyklus af østrogener og progesteron10,11. Således er undersøgelse af livmoderbiologiske mekanismer kompliceret af ovarieindflydelse. For eksempel, når man studerer, hvordan kræftbehandlinger kan påvirke livmoderen, kan det være svært at skelne, om nogen observeret livmoderfænotype (såsom graviditetstab eller menstruationsacyklicitet) er resultatet af en direkte fornærmelse mod livmoderen eller en følgevirkning fra skade på æggestokkene.
For omfattende forståelse af fertiliteten skal livmoderbidragene til graviditet karakteriseres. Det er vigtigt, at denne forståelse skal strække sig ud over livmoderfunktionen under ovariekontrol. Dette kan ikke undersøges hos mennesker; Derfor anvendes dyremodeller ofte. Som sådan er ovariektomi (OVX) almindeligt anvendt til at gøre det muligt for forskere at regulere gnaveres østruscyklusser (analogt med menstruationscyklussen) ved at levere hormoner eksogent. Derudover tillader OVX, at livmoderresponser undersøges uafhængigt af ovariepåvirkning12. Men hvis hormoner ikke straks leveres efter OVX, vil der opstå en overgangsalderfænotype, som skal overvejes nøje af forskerne.
OVX bruges ofte i gnavermodeller 13,14,15,16,17 og er relativt let at udføre efter tilstrækkelig træning. Metoderne varierer afhængigt af, om æggestokken alene eller æggestokken og ovidukten fjernes, samt afhængigt af dyrets alder (voksne, cyklende dyr har større æggestokke med et synligt corpus luteum på deres overflade, hvilket betyder, at deres æggestokke er lettere at visualisere). Tilsvarende, mange metoder til hormontilskud eksisterer, herunder subkutane injektioner14, langsom frigivelse pellets15, osmotiske mini pumper18, og ovarie podning.
I denne artikel gives detaljerede instruktioner om, hvordan man udfører ovariektomi og forbereder tre typer hormontilskud, herunder subkutane injektioner, pellets med langsom frigivelse og osmotiske minipumper. Der findes to detaljerede protokoller for eksperimentelle endepunkter, der drager fordel af OVX efterfulgt af eksogent hormontilskud (embryooverførsel og kunstig decidualisering). Denne artikel diskuterer styrker og svagheder ved hver tilgang med det formål at vejlede forskere om, hvordan man udfører undersøgelser for at isolere virkningerne på livmoderen, specifikt inden for graviditets- og fertilitetsforskningsområderne.
Denne artikel indeholder trinvise instruktioner om, hvordan man udfører OVX og giver eksogene hormoner til undersøgelser med fokus på at forstå livmoderbidragene til graviditet og fertilitet. Der gives to detaljerede protokoller om to eksperimentelle anvendelser af disse metoder, herunder udførelse af embryooverførsel og kunstig decidualisering.
Mens udførelse af OVX kan være udfordrende i starten – især for forskere, der er nye til gnavermodeller – er det en relativt enkel procedure,…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev muliggjort gennem Victorian State Government Operational Infrastructure Support og Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Dette arbejde blev støttet af Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant til A.L.W. (Winship-PAG18-0343) for at få adgang til Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. støttes af DECRA-finansiering DE21010037 fra Australian Research Council (ARC). JNH og LRA understøttes af et australsk regeringsforskningsuddannelsesprogramstipendium. LRA støttes af et Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. er støttet af et ARC Future Fellowship FT190100265.
ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
Estradiol | Sigma | E8875 | |
Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
Sesame oil | Sigma | S3547 | |
Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |