Cellespesifikt parret avhør av musens ovarieepigenom og transkriptom
Summary
I denne protokollen ble metoden for translatering av ribosomaffinitetsrensing (TRAP) og isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT) optimalisert for parret undersøkelse av det cellespesifikke ovarietranskriptomet og epigenomet ved bruk av NuTRAP-musemodellen krysset til en Cyp17a1-Cre muselinje.
Abstract
Vurdering av celletypespesifikke epigenomiske og transkriptomiske endringer er nøkkelen til å forstå aldring av eggstokkene. For dette formål ble optimalisering av metoden for translatering av ribosomaffinitetsrensing (TRAP) og isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT) utført for den påfølgende parede undersøkelsen av det cellespesifikke ovarietranskriptomet og epigenomet ved hjelp av en ny transgen NuTRAP-musemodell. Uttrykket av NuTRAP-allelet er under kontroll av en floxed STOP-kassett og kan målrettes mot spesifikke eggstokkcelletyper ved bruk av promotorspesifikke Cre-linjer. Siden nyere studier har implisert stromale ovarieceller i å drive for tidlig aldrende fenotyper, ble NuTRAP-ekspresjonssystemet målrettet mot stromale celler ved hjelp av en Cyp17a1-Cre-driver. Induksjonen av NuTRAP-konstruksjonen var spesifikk for ovariale stromale fibroblaster, og tilstrekkelig DNA og RNA for sekvenseringsstudier ble oppnådd fra en enkelt ovarie. NuTRAP-modellen og metodene som presenteres her, kan brukes til å studere alle eggstokkcelletyper med en tilgjengelig Cre-linje.
Introduction
Eggstokkene er store aktører i somatisk aldring1, med tydelige bidrag fra spesifikke cellepopulasjoner. Den cellulære heterogeniteten til eggstokken gjør det vanskelig å tolke molekylære resultater fra bulk, hele eggstokkanalyser. Å forstå rollen som spesifikke cellepopulasjoner i aldring av eggstokkene er nøkkelen til å identifisere molekylære drivere som er ansvarlige for fruktbarhet og helsenedgang hos eldre kvinner. Tradisjonelt ble multi-omics-vurderingen av spesifikke eggstokkcelletyper oppnådd ved teknikker som lasermikrodisseksjon2, enkeltcelletilnærminger3 eller cellesortering4. Mikrodisseksjon kan imidlertid være dyrt og vanskelig å utføre, og cellesortering kan endre cellulære fenotypiske profiler5.
En ny tilnærming for å vurdere ovariecelletypespesifikke epigenomiske og transkriptomiske profiler bruker nukleær merking og oversettelse av ribosomaffinitetsrensing (NuTRAP) musemodell. NuTRAP-modellen tillater isolering av celletypespesifikke nukleinsyrer uten behov for cellesortering ved å bruke affinitetsrensingsmetodene: oversette ribosomaffinitetsrensing (TRAP) og isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper (INTAKT)6. Uttrykket av NuTRAP-allelet er under kontroll av en floxed STOP-kassett og kan målrettes mot spesifikke eggstokkcelletyper ved bruk av promotorspesifikke Cre-linjer. Ved å krysse NuTRAP-musen med en celletypespesifikk Cre-linje, forårsaker fjerningen av STOP-kassetten eGFP-merking av det ribosomale komplekset og biotin/mCherry-merking av kjernen på en Cre-avhengig måte6. TRAP- og INACT-teknikkene kan deretter brukes til å isolere mRNA og nukleært DNA fra celletypen av interesse og fortsette til transkriptomiske og epigenomiske analyser.
NuTRAP-modellen har blitt brukt i forskjellige vev, for eksempel fettvev6, hjernevev 7,8,9 og netthinnen 10, for å avsløre celletypespesifikke epigenomiske og transkriptomiske forandringer som kanskje ikke oppdages i helvevshomogenat. Fordelene med NuTRAP-tilnærmingen i forhold til tradisjonelle cellesorteringsteknikker inkluderer følgende: 1) forebygging av ex vivo aktiveringsartefakter8, 2) det minimaliserte behovet for spesialutstyr (dvs. cellesorterere), og 3) økt gjennomstrømning og reduserte kostnader for celletypespesifikke analyser. I tillegg tillater evnen til å isolere celletypespesifikt DNA og RNA fra en enkelt mus parvise analyser som øker den statistiske styrken. Siden nyere studier har implisert stromale celler fra eggstokkene i å drive for tidlig aldrende fenotyper 11,12,13, målrettet vi NuTRAP-ekspresjonssystemet til stromale og theca-celler ved hjelp av en Cyp17a1-Cre-driver. Her demonstrerer vi at induksjonen av NuTRAP-konstruksjonen er spesifikk for ovarie stromale og theca celler, og tilstrekkelig DNA og RNA for sekvenseringsstudier er oppnådd fra en enkelt eggstokk. NuTRAP-modellen og metodene som presenteres her, kan brukes til å studere alle eggstokkcelletyper med en hvilken som helst tilgjengelig Cre-linje.
For generering av en celletypespesifikk ovarie-NuTRAP-muselinje, har kjernefysisk merking og translating ribosomaffinitetsrensing (NuTRAP) allel et floxed STOP-kodon som styrer uttrykket av BirA, biotin ligase anerkjennelse peptid (BLRP)-merket mCherry / mRANGAP1 og eGFP / L10a. Når krysset med en celletypespesifikk Cre-linje, merker uttrykket av NuTRAP-kassetten det nukleære proteinet mRANGAP1 med biotin / mCherry og ribosomalt protein L10a med eGFP på en Cre-avhengig måte. Dette muliggjør isolering av kjerner og mRNA fra spesifikke celletyper uten behov for cellesortering. NuTRAPflox/flox kan pares med en celletypespesifikk Cre relevant for eggstokkcelletyper for å vurdere dette.
Protocol
Representative Results
Discussion
NuTRAP-musemodell6 er en kraftig transgen merkingsmetode for parret undersøkelse av transkriptomet og epigenomet fra spesifikke celletyper som kan tilpasses alle celletyper med en tilgjengelig Cre-driver. Her demonstrerer vi spesifisiteten til Cyp17-NuTRAP-musemodellen ved målretting mot ovarieteca og stromale celler. Cyp17-NuTRAP-modellen kan brukes til å ytterligere belyse theca- og stromalcellespesifikke epigenetiske mekanismer involvert i aldring av eggstokkene, kreft og sykdom.
<p clas…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) og Presbyterian Health Foundation. Dette arbeidet ble også delvis støttet av MERIT-prisen I01BX003906 og en Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP)-pris ISIBX004797 fra USA Institutt for veteransaker, Biomedisinsk laboratorieforskning og utviklingstjeneste. Forfatterne vil også takke Clinical Genomics Center (OMRF) og Imaging Core Facility (OMRF) for hjelp og instrumentbruk.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
Referências
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
