إنشاء نموذج كسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء جراحيا لإنشاء كسر حاجز في عظم الفخذ للفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ، لدراسات التئام الكسور.
Abstract
العظام لديها قدرة كبيرة على التجدد. ومع ذلك ، فإن التئام الكسور عملية معقدة ، واعتمادا على شدة الآفات والعمر والحالة الصحية العامة للمريض ، يمكن أن تحدث حالات فشل ، مما يؤدي إلى تأخر الاتحاد أو عدم الاتحاد. نظرا للعدد المتزايد من الكسور الناتجة عن الصدمات عالية الطاقة والشيخوخة ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة لتحسين إصلاح العظام بناء على مزيج من الخلايا الجذعية الهيكلية / الوسيطة / اللحمة اللحمية والمواد الحيوية المحاكية الحيوية. تحقيقا لهذه الغاية ، يعد استخدام النماذج الحيوانية الموثوقة أمرا أساسيا لفهم الآليات الخلوية والجزيئية الرئيسية التي تحدد نتائج الشفاء بشكل أفضل. من بين جميع النماذج ، يعد الماوس هو نموذج البحث المفضل لأنه يقدم مجموعة متنوعة من السلالات والكواشف المعدلة وراثيا للتحليل التجريبي. ومع ذلك ، قد يكون إنشاء كسور في الفئران تحديا تقنيا بسبب صغر حجمها. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى توضيح إجراءات التأسيس الجراحي لكسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ويشبه عملية إصلاح العظام الأكثر شيوعا ، من خلال تكوين الكالس الغضروفي.
Introduction
الهيكل العظمي هو عضو حيوي ومتعدد الاستخدامات وظيفيا. تمكن عظام الهيكل العظمي من وضع الجسم وحركته ، وتحمي الأعضاء الداخلية ، وتنتج هرمونات تدمج الاستجابات الفسيولوجية ، وهي موقع تكون الدم وتخزين المعادن1. في حالة كسرها ، تتمتع العظام بقدرة ملحوظة على التجدد واستعادة شكلها ووظيفتها قبل الإصابة بالكامل. تبدأ عملية الشفاء بتكوين ورم دموي واستجابة التهابية ، مما يؤدي إلى تنشيط وتكثيف الخلايا الجذعية / السلفية الهيكلية من السمحاق والإندوستيريوم ونخاع العظم وتمايزها اللاحق لتشكيل الكالس الغضروفي الرخو. ثم يحدث سد النهايات المكسورة من خلال عملية تشبه تكوين العظم الغضروفي الداخلي ، حيث تتوسع السقالة الغضروفية ثم تتمعدن ، وتشكل الكالس العظمي الصلب. أخيرا ، يتم إعادة تشكيل الكالس الصلب تدريجيا بواسطة الخلايا الآكلة للعظم وبانيات العظم لاستعادة بنية العظام الأصلية 2,3.
على الرغم من أن عملية التئام الكسور قوية إلى حد ما ، إلا أنها تنطوي على تلخيص معقد للأحداث وتتأثر بشكل كبير بالعديد من العوامل الفردية ، بما في ذلك الحالة الصحية العامة والعمر والجنس للمريض ، بالإضافة إلى عوامل الإصابة ، مثل طريقة التثبيت الميكانيكي للعظم المكسور ، وحدوث العدوى ، وشدة إصابة الأنسجة الرخوة المحيطة4 ، 5,6. لذلك ، فإن الفشل شائع ، مما يؤدي إلى تطوير عدم الاتحاد ، مما يؤثر بشكل كبير على إعادة تأهيل المريض ونوعية الحياة 7,8. نظرا للعدد المتزايد من الكسور نتيجة للصدمات عالية الطاقة والشيخوخة ، فضلا عن ارتفاع تكاليف العلاج ، أصبحت الكسور غير النقابية عبئا على النظم الصحية في جميع أنحاء العالم 9,10. يسلط هذا العبء المتزايد الضوء على الحاجة الملحة لاستراتيجيات علاجية مبتكرة لتحسين إصلاح العظام11,12 بناء على مزيج من الخلايا الجذعية الهيكلية / الوسيطة / اللحمية والمواد الحيوية للمحاكاة الحيوية13,14.
سعيا لتحقيق هذا الهدف ، تم استخدام النماذج الحيوانية على نطاق واسع في الدراسات التي تهدف إلى فهم البيولوجيا الأساسية لآليات التئام الكسور وفي الدراسات قبل السريرية لإثبات المفهوم التي تهدف إلى وضع استراتيجيات علاجية جديدة لتعزيز إصلاح العظام15،16،17. تعتبر النماذج الحيوانية الصغيرة ، مثل الفأر ، ممتازة لدراسات التئام الكسور بسبب التوافر الواسع للسلالات والكواشف المعدلة وراثيا للتحليلات التجريبية وتكاليف صيانتها المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع الفئران بدورة زمنية سريعة للشفاء ، مما يسمح بالتحليل الزمني لجميع مراحل عملية الإصلاح15. ومع ذلك ، فإن صغر حجم يمكن أن يشكل تحديات للإنتاج الجراحي للكسور مع أنماط التثبيت مماثلة لتلك المطبقة في البشر. يصف هذا البروتوكول نموذجا بسيطا ومنخفض التكلفة لالتئام الكسور في الفئران باستخدام قطع عظم الفخذ المفتوح المستقر بسلك داخل النخاع ، والذي يشبه عملية إصلاح العظام الأكثر شيوعا ، من خلال تكوين الكالس الغضروفي ، ويمكن استخدامه في كل من التحقيقات الأساسية والانتقالية التي تتطلب الوصول إلى موقع الكسر.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع زيادة عدد الكسور في جميع أنحاء العالم9،10،25 ، أصبحت العلاجات المبتكرة لعدم الاتحاد ملحة بشكل متزايد. نظرا لأن التئام الكسور ينطوي على جمع معقد ومنظم بإحكام للأحداث التي تحدث على نطاق زمنيطويل 3 ، فإن استخدام نماذج حيوانية ص…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
