Opstellen van een diafysair femurfractuurmodel bij muizen
Summary
Dit protocol beschrijft een chirurgische ingreep voor het vaststellen van een diafysaire fractuur in het dijbeen van muizen, die wordt gestabiliseerd met een intramedullaire draad, voor onderzoeken naar fractuurgenezing.
Abstract
Botten hebben een aanzienlijk regeneratief vermogen. Fractuurgenezing is echter een complex proces en afhankelijk van de ernst van de laesies en de leeftijd en algehele gezondheidstoestand van de patiënt, kunnen storingen optreden, wat leidt tot vertraagde vereniging of non-union. Vanwege het toenemende aantal fracturen als gevolg van hoogenergetisch trauma en veroudering, is de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën om botherstel te verbeteren op basis van de combinatie van skelet-/mesenchymale stam-/stromale cellen en biomimetische biomaterialen dringend nodig. Daartoe is het gebruik van betrouwbare diermodellen van fundamenteel belang voor een beter begrip van de belangrijkste cellulaire en moleculaire mechanismen die de genezingsresultaten bepalen. Van alle modellen is de muis het geprefereerde onderzoeksmodel omdat het een breed scala aan transgene stammen en reagentia biedt voor experimentele analyse. Het vaststellen van fracturen bij muizen kan echter technisch uitdagend zijn vanwege hun kleine formaat. Daarom heeft dit artikel tot doel de procedures te demonstreren voor de chirurgische vaststelling van een diafysaire dijbeenfractuur bij muizen, die wordt gestabiliseerd met een intramedullaire draad en lijkt op het meest voorkomende botherstelproces, door middel van kraakbeenachtige eeltvorming.
Introduction
Het skelet is een vitaal en functioneel veelzijdig orgaan. De botten van het skelet maken lichaamshouding en beweging mogelijk, beschermen de inwendige organen, produceren hormonen die fysiologische reacties integreren en zijn de plaats van hematopoëse en opslag vanmineralen1. Als botten worden gebroken, hebben ze een opmerkelijk vermogen om te regenereren en hun vorm en functie van vóór de verwonding volledig te herstellen. Het genezingsproces begint met de vorming van een hematoom en een ontstekingsreactie, die de activering en condensatie van skeletstam-/voorlopercellen uit het periosteum, endosteum en beenmerg induceert en hun daaropvolgende differentiatie om de zachte kraakbeenachtige callus te vormen. Het overbruggen van de gebroken uiteinden vindt dan plaats door een proces dat lijkt op endochondrale botvorming, waarbij de kraakbeensteiger uitzet en vervolgens mineraliseert, waardoor de harde botachtige callus wordt gevormd. Ten slotte wordt het harde eelt geleidelijk gemodelleerd door osteoclasten en osteoblasten om de oorspronkelijke botstructuur te herstellen 2,3.
Hoewel het genezingsproces van de fractuur redelijk robuust is, omvat het een ingewikkelde optelling van gebeurtenissen en wordt het aanzienlijk beïnvloed door verschillende individuele factoren, waaronder de algemene gezondheidstoestand, leeftijd en geslacht van de patiënt, evenals letselfactoren, zoals de wijze van mechanische stabilisatie van het gebroken bot, het optreden van infectie en de ernst van het omringende letsel aan zacht weefsel4, 5,6. Daarom komen mislukkingen vaak voor, wat leidt tot de ontwikkeling van non-union, wat grote gevolgen heeft voor de revalidatie van de patiënt en de kwaliteit van leven7,8. Door het toenemende aantal fracturen als gevolg van hoogenergetisch trauma en veroudering, evenals de hoge kosten van behandelingen, zijn non-unionfracturen een last geworden voor gezondheidsstelsels wereldwijd 9,10. Deze toenemende belasting benadrukt de dringende behoefte aan innovatieve therapeutische strategieën om botherstel te verbeteren11,12 op basis van de combinatie van skelet-/mesenchymale stam-/stromale cellen en biomimetische biomaterialen13,14.
Bij het nastreven van dit doel zijn diermodellen op grote schaal gebruikt in studies die gericht zijn op het begrijpen van de fundamentele biologie van fractuurgenezingsmechanismen en in proof-of-concept preklinische studies die gericht zijn op het bedenken van nieuwe therapeutische strategieën om botherstel te bevorderen 15,16,17. Modellen van kleine dieren, zoals de muis, zijn uitstekend geschikt voor onderzoek naar de genezing van breuken vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen en reagentia voor experimentele analyses en hun lage onderhoudskosten. Bovendien hebben muizen een snel genezingsverloop, waardoor alle stadia van het herstelproces in de tijd kunnen worden geanalyseerd15. De kleine omvang van het dier kan echter een uitdaging vormen voor de chirurgische productie van fracturen met fixatiemodi die vergelijkbaar zijn met die bij mensen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en goedkoop model van fractuurgenezing bij muizen met behulp van een open femorale osteotomie gestabiliseerd met een intramedullaire draad, die lijkt op het meest voorkomende botherstelproces, door kraakbeenachtige callusvorming, en kan worden gebruikt in zowel basis- als translationeel onderzoek waarbij toegang tot de fractuurplaats vereist is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Naarmate het aantal fracturen wereldwijd toeneemt 9,10,25, worden innovatieve behandelingen voor non-union steeds urgenter. Aangezien fractuurgenezing een complexe en strak georkestreerde opsomming is van gebeurtenissen die zich over een lange tijdschaal voordoen3, is het gebruik van geldige diermodellen van cruciaal belang voor het verbeteren van ons begrip van de mechanismen die het succes van botherste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support van de staat Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
