ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.
Abstract
לעצמות יש יכולת התחדשות משמעותית. עם זאת, ריפוי שברים הוא תהליך מורכב, ובהתאם לחומרת הנגעים ולגיל ולמצב הבריאותי הכללי של המטופל, עלולים להתרחש כשלים, המובילים לאיחוד מאוחר או לאי-איחוד. בשל המספר ההולך וגדל של שברים הנובעים מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, יש צורך דחוף בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים. לשם כך, השימוש במודלים אמינים של בעלי חיים הוא חיוני להבנה טובה יותר של המנגנונים התאיים והמולקולריים העיקריים הקובעים את תוצאות הריפוי. מכל הדגמים, העכבר הוא מודל המחקר המועדף מכיוון שהוא מציע מגוון רחב של זנים וריאגנטים טרנסגניים לניתוח ניסיוני. עם זאת, הקמת שברים בעכברים עשויה להיות מאתגרת מבחינה טכנית בשל גודלם הקטן. לכן, מאמר זה נועד להדגים את ההליכים להקמה כירורגית של שבר עצם הירך הדיאפיזיאלי בעכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי ודומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות.
Introduction
השלד הוא איבר חיוני ורב-תכליתי מבחינה תפקודית. עצמות השלד מאפשרות יציבה ותנועה של הגוף, מגינות על האיברים הפנימיים, מייצרות הורמונים המשלבים תגובות פיזיולוגיות, והן אתר של המטופויזה ואחסון מינרלים1. אם נשברים, לעצמות יש יכולת יוצאת דופן להתחדש ולשחזר באופן מלא את צורתן ותפקודן לפני הפציעה. תהליך הריפוי מתחיל בהיווצרות המטומה ותגובה דלקתית, הגורמת להפעלה ועיבוי של תאי גזע/אב שלדיים מהפריאוסטאום, האנדוסטאום ומח העצם והתמיינותם לאחר מכן ליצירת היבלת הסחוסית הרכה. הגישור בין הקצוות השבורים מתרחש בתהליך הדומה להיווצרות עצם אנדוכונדרלית, שבו הפיגום הסחוסי מתרחב ולאחר מכן עובר מינרליזציה, ויוצר את היבלת האוסאוסית הקשה. לבסוף, היבלת הקשה משופצת בהדרגה על ידי אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים כדי לשחזר את מבנה העצם המקורי 2,3.
למרות שתהליך ריפוי השבר הוא חזק למדי, הוא כרוך בסיכום מורכב של אירועים ומושפע באופן משמעותי ממספר גורמים בודדים, כולל מצבו הבריאותי הכללי, גילו ומינו של המטופל, כמו גם גורמי פציעה, כגון אופן הייצוב המכני של העצם השבורה, התרחשות הזיהום וחומרת הפגיעה ברקמות הרכות שמסביב4, 5,6. לכן, כשלים הם נפוצים, מה שמוביל להתפתחות של אי-איחוד, מה שמשפיע מאוד על שיקום המטופל ואיכות החיים שלו 7,8. בשל המספר ההולך וגדל של שברים כתוצאה מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, כמו גם העלויות הגבוהות של הטיפולים, שברים שאינם מאוגדים הפכו לנטל על מערכות הבריאות ברחבי העולם 9,10. עומס הולך וגובר זה מדגיש את הצורך הדחוף באסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם11,12 המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים13,14.
במטרה להשיג מטרה זו, נעשה שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים במחקרים שמטרתם להבין את הביולוגיה הבסיסית של מנגנוני ריפוי שברים ובמחקרים פרה-קליניים להוכחת היתכנות שמטרתם לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקידום תיקון עצם 15,16,17. מודלים של בעלי חיים קטנים, כמו העכבר, מצוינים למחקרי ריפוי שברים בגלל הזמינות הרחבה של זנים וריאגנטים מהונדסים גנטית לניתוחים ניסיוניים ועלויות התחזוקה הנמוכות שלהם. בנוסף, לעכברים יש מסלול זמן ריפוי מהיר, המאפשר ניתוח זמני של כל שלבי תהליך התיקון15. עם זאת, גודלו הקטן של בעל החיים יכול להציב אתגרים לייצור כירורגי של שברים עם מצבי קיבוע דומים לאלה המיושמים בבני אדם. פרוטוקול זה מתאר מודל פשוט וזול של ריפוי שברים בעכברים באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה של עצם הירך המיוצבת באמצעות חוט תוך מדולרי, הדומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות, וניתן להשתמש בו הן בחקירות בסיסיות והן בחקירות תרגומיות בהן נדרשת גישה לאתר השבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ככל שמספר השברים גדל ברחבי העולם 9,10,25, טיפולים חדשניים לאי-איחוד הופכים דחופים יותר ויותר. מכיוון שריפוי שברים כרוך בסיכום מורכב ומתוזמר היטב של אירועים המתרחשים על פני סקאלת זמן ארוכה3, השימוש במודלים תקפים של בעלי חיים הוא ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן קרלוס צ’אגס פיליו לתמיכה במחקר של מדינת ריו דה ז’ניירו (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
