Stabilire un modello di frattura del femore diafisario nei topi
Summary
Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l’instaurazione di una frattura diafisaria nel femore dei topi, che viene stabilizzata con un filo intramidollare, per studi di guarigione delle fratture.
Abstract
Le ossa hanno una notevole capacità rigenerativa. Tuttavia, la guarigione delle fratture è un processo complesso e, a seconda della gravità delle lesioni, dell’età e dello stato di salute generale del paziente, possono verificarsi fallimenti, che portano a un’unione ritardata o alla mancata unione. A causa del crescente numero di fratture derivanti da traumi ad alta energia e dall’invecchiamento, è urgentemente necessario lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative per migliorare la riparazione ossea basate sulla combinazione di cellule staminali scheletriche/mesenchimali/stromali e biomateriali biomimetici. A tal fine, l’uso di modelli animali affidabili è fondamentale per comprendere meglio i principali meccanismi cellulari e molecolari che determinano gli esiti di guarigione. Di tutti i modelli, il topo è il modello di ricerca preferito perché offre un’ampia varietà di ceppi transgenici e reagenti per l’analisi sperimentale. Tuttavia, l’instaurazione di fratture nei topi può essere tecnicamente impegnativa a causa delle loro piccole dimensioni. Pertanto, questo articolo mira a dimostrare le procedure per l’instaurazione chirurgica di una frattura del femore diafisario nei topi, che è stabilizzata con un filo intramidollare e assomiglia al più comune processo di riparazione ossea, attraverso la formazione di callo cartilagineo.
Introduction
Lo scheletro è un organo vitale e funzionalmente versatile. Le ossa dello scheletro consentono la postura e il movimento del corpo, proteggono gli organi interni, producono ormoni che integrano le risposte fisiologiche e sono il sito dell’emopoiesi e dell’accumulo di minerali1. In caso di frattura, le ossa hanno una notevole capacità di rigenerarsi e ripristinare completamente la loro forma e funzione pre-lesione. Il processo di guarigione inizia con la formazione di un ematoma e di una risposta infiammatoria, che induce l’attivazione e la condensazione delle cellule staminali/progenitrici scheletriche dal periostio, dall’endostio e dal midollo osseo e la loro successiva differenziazione per formare il callo cartilagineo molle. Il ponte delle estremità fratturate avviene quindi attraverso un processo che assomiglia alla formazione dell’osso endocondrale, in cui l’impalcatura cartilaginea si espande e poi si mineralizza, formando il callo osseo duro. Infine, il callo duro viene gradualmente rimodellato da osteoclasti e osteoblasti per ripristinare la struttura ossea originale 2,3.
Sebbene il processo di guarigione della frattura sia abbastanza robusto, comporta un’intricata sommatoria di eventi ed è significativamente influenzato da diversi fattori individuali, tra cui lo stato di salute generale, l’età e il sesso del paziente, nonché fattori di lesione, come la modalità di stabilizzazione meccanica dell’osso fratturato, l’insorgenza di infezioni e la gravità della lesione dei tessuti molli circostanti4, 5,6. Pertanto, i fallimenti sono comuni, portando allo sviluppo della non unione, che ha un forte impatto sulla riabilitazione del paziente e sulla qualità della vita 7,8. A causa del crescente numero di fratture a causa di traumi ad alta energia e dell’invecchiamento, nonché degli alti costi dei trattamenti, le fratture non unionali sono diventate un peso per i sistemi sanitari di tutto il mondo 9,10. Questo onere crescente evidenzia l’urgente necessità di strategie terapeutiche innovative per migliorare la riparazione ossea11,12 basate sulla combinazione di cellule staminali scheletriche/mesenchimali/stromali e biomateriali biomimetici13,14.
Nel perseguimento di questo obiettivo, i modelli animali sono stati ampiamente utilizzati in studi volti a comprendere la biologia fondamentale dei meccanismi di guarigione delle fratture e in studi preclinici proof-of-concept volti a ideare nuove strategie terapeutiche per promuovere la riparazione ossea 15,16,17. I modelli di piccoli animali, come il topo, sono eccellenti per gli studi di guarigione delle fratture grazie all’ampia disponibilità di ceppi e reagenti geneticamente modificati per le analisi sperimentali e ai loro bassi costi di manutenzione. Inoltre, i topi hanno un rapido decorso temporale di guarigione, che consente l’analisi temporale di tutte le fasi del processo di riparazione15. Tuttavia, le piccole dimensioni dell’animale possono rappresentare una sfida per la produzione chirurgica di fratture con modalità di fissazione simili a quelle applicate nell’uomo. Questo protocollo descrive un modello semplice e a basso costo di guarigione delle fratture nei topi utilizzando un’osteotomia femorale aperta stabilizzata con un filo intramidollare, che assomiglia al più comune processo di riparazione ossea, attraverso la formazione di callo cartilagineo, e può essere utilizzato sia in indagini di base che traslazionali in cui è richiesto l’accesso al sito di frattura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con l’aumento del numero di fratture in tutto il mondo 9,10,25, i trattamenti innovativi per la mancata unione stanno diventando sempre più urgenti. Poiché la guarigione delle fratture comporta una somma complessa e strettamente orchestrata di eventi che si verificano su un lungo arco temporale3, l’uso di modelli animali validi è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi che det…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il sostegno alla ricerca dello Stato di Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
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