マウスにおける骨幹大腿骨骨折モデルの確立
1Postgraduate Program in Biological Sciences – Biophysics, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho,Federal University of Rio de Janeiro, 2Postgraduate Program in Surgical Sciences, Faculty of Medicine,Federal University of Rio de Janeiro, 3Institute of Biomedical Sciences,Federal University of Rio de Janeiro
Summary
このプロトコルは、骨折治癒研究のために、髄内ワイヤーで安定化されるマウスの大腿骨に骨幹骨折を確立するための外科的処置を説明しています。
Abstract
骨には大きな再生能力があります。しかし、骨折治癒は複雑なプロセスであり、病変の重症度や患者の年齢や全体的な健康状態によっては、失敗が発生し、癒合の遅延や癒合不全につながる可能性があります。高エネルギー外傷や加齢による骨折の増加により、骨格/間葉系幹細胞/間質細胞と生体模倣生体材料の組み合わせに基づく骨修復を改善する革新的な治療戦略の開発が急務となっています。この目的のために、信頼できる動物モデルの使用は、治癒結果を決定する主要な細胞および分子メカニズムをよりよく理解するための基本です。すべてのモデルの中で、マウスは実験的分析のための多種多様なトランスジェニック株と試薬を提供するため、好ましい研究モデルです。しかし、マウスの骨折の確立は、サイズが小さいため、技術的に困難な場合があります。したがって、この記事は、軟骨カルスの形成を通じて、髄内ワイヤーで安定化し、最も一般的な骨修復プロセスに類似しているマウスの骨幹骨折の外科的確立の手順を示すことを目的としています。
Introduction
骨格は重要で機能的に用途の広い器官です。骨格の骨は、体の姿勢と動きを可能にし、内臓を保護し、生理学的反応を統合するホルモンを産生し、造血とミネラル貯蔵の部位です1。骨折した場合、骨は再生し、損傷前の形態と機能を完全に回復させる驚くべき能力を持っています。治癒過程は、血腫の形成と炎症反応から始まり、骨膜、骨内膜、骨髄からの骨格幹細胞/前駆細胞の活性化と凝縮、およびその後の分化が誘発され、軟軟骨性カルスが形成されます。骨折した端の架橋は、軟骨骨の足場が膨張し、次に石灰化し、硬い骨カルスを形成する軟骨内骨形成に似たプロセスを通じて起こります。最後に、硬カルスは破骨細胞と骨芽細胞によって徐々にリモデリングされ、元の骨構造が復元されます2,3。
骨折治癒過程はかなり頑健であるが、事象の複雑な総和を伴い、患者の一般的な健康状態、年齢、性別、ならびに骨折した骨の機械的安定化の様式、感染の発生、周囲の軟部組織の損傷の重症度などの傷害要因など、いくつかの個別要因に大きく影響される4。5、6。したがって、失敗は一般的であり、非癒合の発症につながり、患者のリハビリテーションと生活の質に大きな影響を与えます7,8。高エネルギーの外傷と加齢の結果としての骨折の数の増加、および治療費の高騰により、非癒合骨折は世界中の医療システムの負担になっています9,10。この負担の増加は、骨格/間葉系幹細胞/間質細胞と生体模倣生体材料の組み合わせに基づく骨修復を改善するための革新的な治療戦略の緊急の必要性を浮き彫りにしています11,12。
この目標を追求するために、動物モデルは、骨折治癒メカニズムの基礎生物学を理解することを目的とした研究や、骨修復を促進するための新しい治療戦略を考案することを目的とした概念実証の前臨床試験で広く使用されています15,16,17。マウスなどの小動物モデルは、実験分析用の遺伝子組み換え株や試薬が広く入手でき、メンテナンスコストが低いため、骨折治癒研究に最適です。さらに、マウスは急速な治癒時間経過を有し、これにより、修復過程のすべての段階の時間的分析が可能になる15。しかし、動物のサイズが小さいため、人間に適用されるものと同様の固定モードを備えた骨折の外科的生成に課題をもたらす可能性があります。このプロトコルは軟骨のカルスの形成によって共通の骨の修理プロセスに類似している髄内ワイヤーと安定する開いた大腿骨の骨切り術を使用してマウスのひびの治療の簡単で、安価モデルを記述し、ひびの場所へのアクセスが要求される基本的なおよびtranslational調査で使用することができる。
Protocol
すべての実験は、リオデジャネイロ連邦大学健康科学センターの動物利用およびケア委員会によって承認されました(プロトコル番号101/21)。この研究では、10〜12週齢(体重25〜30g)の雄のBalb / cマウスを使用しました。外科的処置は、マウスあたり約15〜20分かかります。各手順の前に、必要な器具( 材料表に記載)を手術台を覆う無菌手術野に整理する必要があります(…
Representative Results
骨折の原因となる外科的処置の成功を評価する最も簡単で直接的な方法は、X線画像診断です。X線写真は、マウスを麻酔下に置いたまま手術直後に実施し、その後、骨折後7日、14日、および21日後に実施して、カルスの形成と進行を評価することができます。許容される骨折パターンは、皮質が完全に破裂し、ワイヤーが髄管内に正しく配置され、骨折線が横方向(骨の軸に対して90°の角度)、…
Discussion
世界中で骨折の数が増加するにつれて 9,10,25、非癒合症の革新的な治療法はますます緊急性を増しています。骨折治癒には、長い時間スケールで発生する事象の複雑で緊密に調整された総和が含まれるため3、有効な動物モデルの使用は、骨修復の成功を決定するメカニズムの理解を深め、効果的な薬と治…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、リオデジャネイロ州のカルロス・シャガス・フィーリョ研究支援財団(FAPERJ)から資金提供を受けました。
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
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Citar este artigo
Braga Frade, B., Dias da Cunha Muller, L., Bonfim, D. C. Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice. J. Vis. Exp. (190), e64766, doi:10.3791/64766 (2022).