Etablering av en diafyseal lårbensbruddmodell hos mus
Summary
Denne protokollen beskriver en kirurgisk prosedyre for etablering av et diafysealbrudd i lårbenet hos mus, som er stabilisert med en intramedullær ledning, for bruddhelingsstudier.
Abstract
Ben har en betydelig regenerativ kapasitet. Imidlertid er bruddheling en kompleks prosess, og avhengig av alvorlighetsgraden av lesjonene og pasientens alder og generelle helsestatus, kan det oppstå feil som fører til forsinket forening eller nonunion. På grunn av det økende antallet brudd som følge av høyenergitraumer og aldring, er det et presserende behov for utvikling av innovative terapeutiske strategier for å forbedre beinreparasjon basert på kombinasjonen av skjelett / mesenkymale stamme / stromale celler og biomimetiske biomaterialer. For dette formål er bruken av pålitelige dyremodeller grunnleggende for bedre å forstå de viktigste cellulære og molekylære mekanismene som bestemmer helbredelsesresultatene. Av alle modellene er musen den foretrukne forskningsmodellen fordi den tilbyr et bredt utvalg av transgene stammer og reagenser for eksperimentell analyse. Imidlertid kan etablering av brudd hos mus være teknisk utfordrende på grunn av deres lille størrelse. Derfor har denne artikkelen som mål å demonstrere prosedyrene for kirurgisk etablering av en diafyseal lårbenbrudd hos mus, som er stabilisert med en intramedullær ledning og ligner den vanligste beinreparasjonsprosessen, gjennom bruskdannelse.
Introduction
Skjelettet er et vitalt og funksjonelt allsidig organ. Skjelettets bein muliggjør kroppsstilling og bevegelse, beskytter de indre organene, produserer hormoner som integrerer fysiologiske responser, og er stedet for hematopoiesis og minerallagring1. Hvis brukket, bein har en bemerkelsesverdig evne til å regenerere og fullt ut gjenopprette sin pre-skade form og funksjon. Helingsprosessen begynner med dannelsen av et hematom og en inflammatorisk respons, som induserer aktivering og kondensering av skjelettstamme / stamceller fra periosteum, endosteum og benmarg og deres påfølgende differensiering for å danne den myke bruskkallusen. Broen mellom de frakturerte endene skjer da gjennom en prosess som ligner endokondral beindannelse, hvor bruskstillaset ekspanderer og deretter mineraliserer, danner den harde osseous callus. Til slutt blir hard callus gradvis ombygd av osteoklaster og osteoblaster for å gjenopprette den opprinnelige beinstrukturen 2,3.
Selv om bruddhelingsprosessen er ganske robust, innebærer den en intrikat oppsummering av hendelser og påvirkes betydelig av flere individuelle faktorer, inkludert pasientens generelle helsestatus, alder og kjønn, samt skadefaktorer, for eksempel modusen for mekanisk stabilisering av brukket bein, forekomsten av infeksjon og alvorlighetsgraden av den omkringliggende bløtvevsskaden4, 5,6. Derfor er feil vanlige, noe som fører til utvikling av nonunion, noe som i stor grad påvirker pasientrehabilitering og livskvalitet 7,8. På grunn av det økende antall brudd som følge av høyenergitraumer og aldring, samt de høye kostnadene ved behandlinger, har nonunion-brudd blitt en byrde for helsesystemer over hele verden 9,10. Denne økende byrden understreker det presserende behovet for innovative terapeutiske strategier for å forbedre beinreparasjon11,12 basert på kombinasjonen av skjelett / mesenkymale stamme / stromale celler og biomimetiske biomaterialer13,14.
I jakten på dette målet har dyremodeller blitt mye brukt i studier som tar sikte på å forstå den grunnleggende biologien til bruddhelingsmekanismer og i proof-of-concept prekliniske studier som tar sikte på å utarbeide nye terapeutiske strategier for å fremme beinreparasjon 15,16,17. Smådyrmodeller, som musen, er utmerket for bruddhelingsstudier på grunn av den brede tilgjengeligheten av genetisk modifiserte stammer og reagenser for eksperimentelle analyser og deres lave vedlikeholdskostnader. I tillegg har mus et raskt helbredelsestidsforløp, noe som muliggjør tidsmessig analyse av alle stadier av reparasjonsprosessen15. Den lille størrelsen på dyret kan imidlertid utgjøre utfordringer for kirurgisk produksjon av brudd med fikseringsmoduser som ligner de som brukes hos mennesker. Denne protokollen beskriver en enkel og billig modell for bruddheling hos mus ved bruk av en åpen femoral osteotomi stabilisert med en intramedullær ledning, som ligner den vanligste beinreparasjonsprosessen, gjennom bruskdannelse, og kan brukes både i grunnleggende og translasjonsundersøkelser der tilgang til bruddstedet er nødvendig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etter hvert som antall brudd øker over hele verden 9,10,25, blir innovative behandlinger for nonunion stadig mer presserende. Siden bruddheling innebærer en kompleks og tett orkestrert oppsummering av hendelser som skjer over en lang tidsskala3, er bruk av gyldige dyremodeller sentralt for å forbedre vår forståelse av mekanismene som bestemmer suksessen til beinreparasjon og for å velge effektive me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
