Создание модели диафизарного перелома бедренной кости у мышей
Summary
В данном протоколе описывается хирургическая процедура по установлению диафизарного перелома бедренной кости мышей, которая стабилизируется интрамедуллярной проволокой, для исследований заживления перелома.
Abstract
Кости обладают значительной регенеративной способностью. Однако заживление переломов является сложным процессом, и в зависимости от тяжести поражений, возраста и общего состояния здоровья пациента могут возникать сбои, приводящие к отсроченному сращению или несращению. В связи с растущим числом переломов, возникающих в результате высокоэнергетических травм и старения, срочно необходима разработка инновационных терапевтических стратегий для улучшения восстановления костей, основанных на комбинации скелетных/мезенхимальных стволовых/стромальных клеток и биомиметических биоматериалов. С этой целью использование надежных моделей на животных имеет основополагающее значение для лучшего понимания ключевых клеточных и молекулярных механизмов, определяющих результаты лечения. Из всех моделей мышь является предпочтительной моделью исследования, поскольку она предлагает широкий спектр трансгенных штаммов и реагентов для экспериментального анализа. Тем не менее, установление переломов у мышей может быть технически сложной задачей из-за их небольшого размера. Поэтому целью данной статьи является демонстрация процедур хирургического установления диафизарного перелома бедренной кости у мышей, который стабилизируется интрамедуллярной проволокой и напоминает наиболее распространенный процесс восстановления кости, посредством образования хрящевой мозоли.
Introduction
Скелет является жизненно важным и функционально универсальным органом. Кости скелета обеспечивают осанку и движения тела, защищают внутренние органы, вырабатывают гормоны, которые интегрируют физиологические реакции, и являются местом кроветворенияи накопления минералов. При переломе кости обладают замечательной способностью к регенерации и полному восстановлению своей формы и функции до травмы. Процесс заживления начинается с образования гематомы и воспалительной реакции, которая индуцирует активацию и конденсацию скелетных стволовых/прогениторных клеток из надкостницы, эндостея и костного мозга и их последующую дифференцировку с образованием мягкой хрящевой мозоли. Сращивание сломанных концов происходит с помощью процесса, напоминающего формирование эндохондральной кости, при котором хрящевой каркас расширяется, а затем минерализуется, образуя твердую костную мозоль. Наконец, твердая мозоль постепенно ремоделируется остеокластами и остеобластами для восстановления первоначальной структуры кости 2,3.
Несмотря на то, что процесс заживления перелома является достаточно прочным, он включает в себя сложную совокупность событий и в значительной степени зависит от нескольких индивидуальных факторов, включая общее состояние здоровья, возраст и пол пациента, а также факторы травмы, такие как режим механической стабилизации сломанной кости, возникновение инфекции и тяжесть окружающего повреждения мягких тканей4, 5,6. Таким образом, часто случаются неудачи, приводящие к развитию несращения, что значительно влияет на реабилитацию пациента икачество жизни 7,8. Из-за растущего числа переломов в результате высокоэнергетических травм и старения, а также высокой стоимости лечения, несросшиеся переломы стали бременем для систем здравоохранения во всем мире 9,10. Это растущее бремя подчеркивает настоятельную потребность в инновационных терапевтических стратегиях для улучшения восстановления костной ткани11,12, основанных на комбинации скелетных/мезенхимальных стволовых/стромальных клеток и биомиметических биоматериалов13,14.
Для достижения этой цели животные модели широко использовались в исследованиях, направленных на понимание фундаментальной биологии механизмов заживления переломов, а также в доклинических исследованиях, направленных на разработку новых терапевтических стратегий, способствующих восстановлению костной ткани 15,16,17. Модели мелких животных, таких как мыши, отлично подходят для исследований заживления переломов из-за широкой доступности генетически модифицированных штаммов и реагентов для экспериментального анализа и низких затрат на их обслуживание. Кроме того, у мышей наблюдается быстрый ход заживления, что позволяет проводить временной анализ всех этапов процесса репарации15. Тем не менее, небольшой размер животного может создать проблемы для хирургического получения переломов с режимами фиксации, аналогичными тем, которые применяются у людей. Этот протокол описывает простую и недорогую модель заживления переломов у мышей с использованием открытой остеотомии бедренной кости, стабилизированной интрамедуллярной проволокой, которая напоминает наиболее распространенный процесс восстановления кости путем образования хрящевой мозоли, и может быть использована как в базовых, так и в трансляционных исследованиях, при которых требуется доступ к месту перелома.
Protocol
Representative Results
Discussion
По мере того, как количество переломов во всем мире увеличивается 9,10,25, инновационные методы лечения несращений становятся все более актуальными. Поскольку заживление переломов включает в себя сложную и строго организованную суммаци?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Фондом поддержки научных исследований штата Рио-де-Жанейро имени Карлоса Шагаса Фильо (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
