Farelerde Diafiz Femur Kırığı Modelinin Kurulması
Summary
Bu protokol, kırık iyileşme çalışmaları için intramedüller tel ile stabilize edilen farelerin uyluk kemiğinde diyafiz kırığı oluşturulması için cerrahi bir prosedürü açıklar.
Abstract
Kemikler önemli bir rejeneratif kapasiteye sahiptir. Bununla birlikte, kırık iyileşmesi karmaşık bir süreçtir ve lezyonların ciddiyetine ve hastanın yaşına ve genel sağlık durumuna bağlı olarak, gecikmiş kaynama veya kaynamama ile sonuçlanan başarısızlıklar meydana gelebilir. Yüksek enerjili travma ve yaşlanmadan kaynaklanan kırık sayısının artması nedeniyle, iskelet/mezenkimal kök/stromal hücreler ve biyomimetik biyomateryallerin kombinasyonuna dayalı kemik onarımını iyileştirmek için yenilikçi terapötik stratejilerin geliştirilmesine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bu amaçla, güvenilir hayvan modellerinin kullanılması, iyileşme sonuçlarını belirleyen temel hücresel ve moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için esastır. Tüm modeller arasında fare, deneysel analiz için çok çeşitli transgenik suşlar ve reaktifler sunduğu için tercih edilen araştırma modelidir. Bununla birlikte, farelerde kırıkların oluşturulması, küçük boyutları nedeniyle teknik olarak zor olabilir. Bu nedenle, bu makale, farelerde intramedüller tel ile stabilize edilen ve en sık görülen kemik onarım sürecini andıran diyafiz femur kırığının kıkırdaklı kallus oluşumu yoluyla cerrahi olarak oluşturulmasına yönelik prosedürleri göstermeyi amaçlamaktadır.
Introduction
İskelet, hayati ve işlevsel olarak çok yönlü bir organdır. İskeletin kemikleri vücut duruşunu ve hareketini sağlar, iç organları korur, fizyolojik tepkileri bütünleştiren hormonlar üretir ve hematopoez ve mineral depolama alanıdır1. Kırılırsa, kemikler yaralanma öncesi form ve işlevlerini yenilemek ve tamamen eski haline getirmek için dikkate değer bir kapasiteye sahiptir. İyileşme süreci, periost, endosteum ve kemik iliğinden iskelet kökü/progenitör hücrelerinin aktivasyonunu ve yoğunlaşmasını ve ardından yumuşak kıkırdaklı kallusu oluşturmak üzere farklılaşmasını indükleyen bir hematom ve enflamatuar bir yanıt oluşumu ile başlar. Kırık uçların köprülenmesi daha sonra, kıkırdaklı iskelenin genişlediği ve daha sonra mineralleşerek sert kemikli nasırı oluşturduğu endokondral kemik oluşumuna benzeyen bir süreçle gerçekleşir. Son olarak, sert nasır, orijinal kemik yapısını eski haline getirmek için osteoklastlar ve osteoblastlar tarafından kademeli olarak yeniden şekillendirilir 2,3.
Kırık iyileşme süreci oldukça sağlam olmasına rağmen, olayların karmaşık bir özetini içerir ve hastanın genel sağlık durumu, yaşı ve cinsiyeti gibi çeşitli bireysel faktörlerin yanı sıra kırık kemiğin mekanik stabilizasyon modu, enfeksiyon oluşumu ve çevredeki yumuşak doku yaralanmasının ciddiyeti gibi yaralanma faktörlerinden önemli ölçüde etkilenir4, 5,6. Bu nedenle, başarısızlıklar yaygındır ve hasta rehabilitasyonunu ve yaşam kalitesini büyük ölçüde etkileyen kaynamama gelişimine yol açar 7,8. Yüksek enerjili travma ve yaşlanma sonucu artan kırık sayısı ve tedavi maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle kaynamayan kırıklar dünya çapında sağlık sistemleri için bir yük haline gelmiştir 9,10. Bu artan yük, iskelet/mezenkimal kök/stromal hücreler ve biyomimetik biyomateryallerin 13,14 kombinasyonuna dayalı olarak kemik onarımını11,12 iyileştirmek için yenilikçi terapötik stratejilere olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır.
Bu amaç doğrultusunda, kırık iyileşme mekanizmalarının temel biyolojisini anlamayı amaçlayan çalışmalarda ve kemik onarımını desteklemek için yeni terapötik stratejiler geliştirmeyi amaçlayan kavram kanıtı klinik öncesi çalışmalarda hayvan modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır 15,16,17. Fare gibi küçük hayvan modelleri, deneysel analizler için genetiği değiştirilmiş suşların ve reaktiflerin geniş mevcudiyeti ve düşük bakım maliyetleri nedeniyle kırık iyileştirme çalışmaları için mükemmeldir. Ek olarak, fareler, onarım sürecinin tüm aşamalarının zamansal analizine izin veren hızlı bir iyileşme süresi seyrine sahiptir15. Bununla birlikte, hayvanın küçük boyutu, insanlarda uygulananlara benzer fiksasyon modlarına sahip kırıkların cerrahi üretimi için zorluklar oluşturabilir. Bu protokol, kıkırdaklı kallus oluşumu yoluyla en yaygın kemik onarım sürecine benzeyen intramedüller tel ile stabilize edilmiş açık bir femoral osteotomi kullanan farelerde basit ve düşük maliyetli bir kırık iyileşmesi modelini tanımlar ve kırık bölgesine erişimin gerekli olduğu hem temel hem de translasyonel araştırmalarda kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dünya çapında kırık sayısıarttıkça 9,10,25, kaynamama için yenilikçi tedaviler giderek daha acil hale gelmektedir. Kırık iyileşmesi, uzun bir zaman ölçeğindemeydana gelen olayların karmaşık ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir toplamını içerdiğinden3, geçerli hayvan modellerinin kullanılması, kemik onarımının başarısını belirleyen mekanizmaları anlamamızı ve etkili…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Rio de Janeiro Eyaleti Araştırma Desteği için Carlos Chagas Filho Vakfı (FAPERJ) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
Referências
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
