الميالين في المختبر للمحاور المحيطية في زراعة مشتركة لنباتات العقدة الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان
Summary
في نظام الاستزراع المشترك للعقد الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، يمكن دراسة الميالين في الجهاز العصبي المحيطي. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لمراقبة الميالين المحيطي وقياسه ودراسة تأثيرات المركبات ذات الأهمية على غمد الميالين.
Abstract
عملية الميالين ضرورية لتمكين نقل إشارة سريعة وكافية في الجهاز العصبي. في الجهاز العصبي الطرفي، تشارك الخلايا العصبية وخلايا شوان في تفاعل معقد للتحكم في ميالين المحاور العصبية. اضطرابات هذا التفاعل وانهيار غمد المايلين هي السمات المميزة لاعتلالات الأعصاب الالتهابية وتحدث بشكل ثانوي في الاضطرابات التنكسية العصبية. نقدم هنا نموذجا للاستزراع المشترك لنباتات العقدة الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، والتي تطور ميالين قويا للمحاور العصبية الطرفية لدراسة عملية الميالين في الجهاز العصبي الطرفي ، ودراسة تفاعلات الخلايا المحورية وشوان ، وتقييم التأثيرات المحتملة للعوامل العلاجية على كل نوع من الخلايا على حدة. من الناحية المنهجية ، تم حصاد العقد الجذرية الظهرية للفئران الجنينية (E13.5) ، وفصلها عن الأنسجة المحيطة بها ، واستزراعها كنباتات كاملة لمدة 3 أيام. تم عزل خلايا شوان من الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع ، وتم هضم الأعصاب الوركية إنزيميا. تم تنقية خلايا شوان الناتجة عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا واستزراعها في ظل ظروف تخصيب النيوريجولين وفورسكولين. بعد 3 أيام من زراعة العقدة الجذرية الظهرية ، تمت إضافة 30000 خلية شوان إلى مزرعة واحدة من العقدة الجذرية الظهرية في وسط يحتوي على حمض الأسكوربيك. تم الكشف عن العلامات الأولى للميالين في اليوم 10 من الزراعة المشتركة ، من خلال إشارات متفرقة لبروتين المايلين الأساسي في تلطيخ الخلايا المناعية الكيميائية. من اليوم 14 فصاعدا، تكونت أغلفة الميالين وانتشرت على طول المحاور. يمكن قياس الميالين كميا عن طريق تلطيخ البروتين الأساسي للمايلين كنسبة بين مساحة الميالين والمنطقة المحورية، لحساب الاختلافات في الكثافة المحورية. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لدراسة الجوانب المختلفة للميالين المحيطي في المختبر ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم علم الأمراض وفرص العلاج الممكنة لإزالة الميالين والتنكس العصبي في الأمراض الالتهابية والتنكسية العصبية في الجهاز العصبي المحيطي.
Introduction
في الجهاز العصبي الطرفي (PNS) ، يتم نقل المعلومات السريع بوساطة محاور مغلفة بالمايلين. يعد الميالين في المحاور العصبية ضروريا لتمكين الانتشار السريع للنبضات الكهربائية ، لأن سرعة توصيل الألياف العصبية ترتبط بقطر المحور العصبي وسمكالمايلين 1. تعتمد الإشارات الحسية من المحيط إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) على تنشيط الخلايا العصبية الحسية من الدرجة الأولى الموجودة في تضخم الجذر الظهري ، والتي تسمى العقد الجذرية الظهرية (DRG). لتكوين الميالين وصيانته ، يكون الاتصال المستمر بين المحاور العصبية وخلايا شوان ، وهي خلايا الخلايا الدبقية الميالينية في الجهاز العصبي الطرفي ، إلزاميا2.
تزعج العديد من أمراض الجهاز العصبي الطرفي نقل المعلومات إما عن طريق تلف محوري أولي أو مزيل للميالين ، مما يؤدي إلى نقص الحس أو خلل الحس. تتمتع الخلايا العصبية الحسية من الدرجة الأولى بالقدرة على التجدد إلى حد ما بعد تلف الخلايا العصبية ، من خلال تفاعل معقد بين الخلايا العصبية وخلايا شوان المحيطة3. في هذه الحالة ، يمكن أن تخضع خلايا شوان لإعادة البرمجة الخلوية لإزالة حطام المحور العصبي وكذلك المايلين وتعزيز تجديد المحور العصبي ، مما يؤدي إلى إعادة الميالين4. من المهم فهم آليات الميالين في الصحة والمرض ، من أجل إيجاد خيارات العلاج الممكنة لاضطرابات إزالة الميالين في الجهاز العصبي الطرفي. يمكن أيضا أن يتلف المايلين بسبب الصدمات العصبية الحادة ، والأساليب لتعزيز الميالين لتعزيز الانتعاش الوظيفي بعد إصابة الأعصاب الطرفية قيد التحقيق5.
استفادت معرفتنا بالميالين المحيطي إلى حد كبير من الزراعات المشتركة الميالينية لخلايا شوان والخلايا العصبية الحسية. منذ تطبيق الأساليب الأولى6،7،8 ، تمت دراسة الميالين بشكل مكثف باستخدام أنظمة الاستزراع المشتركالمختلفة 9،10،11. هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وسهلا للميالين القوي في المختبر لمحاور العقدة الجذرية الظهرية. يعتمد بروتوكول تحضير خلية شوان على بروتوكول Andersen et al.12 ، الذي نشر سابقا في Pitarokoili et al.13. نحن نستخدم خلايا شوان المشتقة من الفئران اليافعة ومزارع DRG الجنينية للزراعة المشتركة ، حيث يحدث الميالين في حوالي اليوم 14. الهدف من هذه الطريقة هو توفير نظام للتحقيق في تكوين المايلين نتيجة للتفاعل المباشر بين خلية محور عصبي وشوان ، ودراسة معدلات الميالين PNS. بالمقارنة مع مزارع الخلايا العصبية المنفصلة ، يتم الحفاظ على نباتات DRG تشريحيا بشكل أكبر وتشكل عمليات محورية طويلة. يوفر القياس الكمي لمنطقة المحور العصبي المياليني قراءة كافية للميالين في الزراعة المشتركة. هذه الطريقة هي أداة قيمة لفحص المركبات العلاجية لتأثيرها المحتمل على الميالين العصبي الطرفي ، ويمكن استخدامها أيضا بالإضافة إلى الدراسات في الجسم الحي في النماذج الحيوانية14.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وسهلا لتوليد الميالين في المختبر عن طريق دمج ثقافتين منفصلتين من نوع الخلية ، خلايا شوان ونباتات العقدة الجذرية الظهرية.
تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في زراعة نباتات DRG ، خاصة في الأيام الأولى للثقافة. DRG هشة للغاية قبل بناء شبكة محورية …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأستاذ الدكتور رالف جولد والأستاذة الدكتورة جيسا إلريشمان على نصائحهم ودعمهم.
Materials
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
Referências
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
