No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.
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Artigo de método
Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann
Neste artigo
Resumo
Resumo
O processo de mielinização é essencial para permitir a transdução rápida e suficiente do sinal no sistema nervoso. No sistema nervoso periférico, neurônios e células de Schwann se envolvem em uma interação complexa para controlar a mielinização dos axônios. Distúrbios dessa interação e quebra da bainha de mielina são características das neuropatias inflamatórias e ocorrem secundariamente em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos um modelo de cocultura de explantes do gânglio da raiz dorsal e células de Schwann, que desenvolve uma mielinização robusta de axônios periféricos para investigar o processo de mielinização no sistema nervoso periférico, estudar as interações axônio-célula de Schwann e avaliar os potenciais efeitos dos agentes terapêuticos sobre cada tipo celular separadamente. Metodologicamente, gânglios da raiz dorsal de ratos embrionários (E13.5) foram colhidos, dissociados de seu tecido circundante e cultivados como explantes inteiros por 3 dias. Células de Schwann foram isoladas de ratos adultos com 3 semanas de idade, e os nervos ciáticos foram digeridos enzimaticamente. As células de Schwann resultantes foram purificadas por triagem celular ativada por magnetismo e cultivadas sob condições enriquecidas com neuregulina e forskolina. Após 3 dias de cultura do explante do gânglio da raiz dorsal, 30.000 células de Schwann foram adicionadas a um explante do gânglio da raiz dorsal em meio contendo ácido ascórbico. Os primeiros sinais de mielinização foram detectados no 10º dia de cocultivo, através de sinais esparsos para proteína básica de mielina na coloração imunocitoquímica. A partir do 14º dia, bainhas de mielina foram formadas e propagadas ao longo dos axônios. A mielinização pode ser quantificada pela coloração da proteína básica da mielina como uma razão entre a área de mielinização e a área axonal, para explicar as diferenças na densidade axonal. Este modelo oferece oportunidades experimentais para o estudo de vários aspectos da mielinização periférica in vitro, o que é crucial para a compreensão da patologia e possíveis oportunidades de tratamento para desmielinização e neurodegeneração em doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico.
Introdução
No sistema nervoso periférico (SNP), a rápida transdução de informação é mediada por axônios envoltos em mielina. A mielinização dos axônios é essencial para permitir a rápida propagação dos impulsos elétricos, uma vez que a velocidade de condução das fibras nervosas correlaciona-se com o diâmetro do axônio e a espessura da mielina1. A sinalização sensorial da periferia para o sistema nervoso central (SNC) depende da ativação de neurônios sensoriais de primeira ordem que residem em ampliações da raiz dorsal, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG). Para a formação e manutenção da mielina,é obrigatória a comunicação con....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Cultura de células de Schwann
- Revestimento para cultura de células de Schwann
- Revestir as placas de cultura celular em condições estéreis. Aplicar 2 mL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% em duas placas de cultura de tecidos (CT) de 60 mm cada e incubar durante a noite a 4 °C.
- Retire o PLL, lave as placas de TC 2x com água destilada e incube com 2 mL de laminina 1 μg/cm2 durante a noite a 4 °C. Lave as placas TC 2x com aqua dest, e deixe ....
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Resultados
A mielinização na cocultura foi avaliada nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os explantes DRG e as células de Schwann foram corados para MBP, βIII-tubulina e DAPI. A rede axonal na cocultura foi densa e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação. Os primeiros sinais de mielina, na forma de pequenos fragmentos, foram detectáveis no 10º dia e aumentaram no 12º dia (Figura 2). As áreas positivas para PAM aumentaram ao longo do tempo até o 20º dia de cultura. A mielinização foi.......
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Discussão
Aqui, apresentamos um protocolo rápido e fácil para a geração de mielinização in vitro através da fusão de duas culturas de tipos celulares distintas, células de Schwann e explantes do gânglio da raiz dorsal.
Uma etapa crítica do protocolo é o cultivo de explantes DRG, especialmente nos primeiros dias de cultivo. Os DRG são muito frágeis antes que uma rede axonal forte seja construída e devem ser manuseados com muito cuidado, por exemplo, quando retirados da incubadora ou durante uma .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Prof. Dr. Ralf Gold e à Dra. Gisa Ellrichmann pela assessoria e apoio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, coelho | Novus Biologicals, Centannial, EUA | ABIN446360 | |
| Anti-ß III-tubulina de camundongo | Biolegend, San Diego, EUA | 657402 | |
| Ácido ascórbico | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | A4403-100MG | |
| B27-suplemento | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | 17504-044 | |
| Ponta do Filtro Biosphere, 100 µ L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Ponta de Filtro Biosphere, 1250 µ L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Ponta de Filtro Biosphere, 20 µ L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Ponta de Filtro Biosphere, 300 µ L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Albumina de soro bovino | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 8076.4 | |
| Filtro de células, 100 µ M | BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha | 352360 | |
| Centrífuga 5810-R | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 5811000015 | |
| Incubadora CO2 Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha | ||
| Lamínulas 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | P231.1 | |
| Pinça fina curvada | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Alemanha | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | ||
| Água destilada (Sistema de Purificação de Água) | Millipore, Molsheim, França | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| DPBS (sem Ca2+ e sem Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | D8537-6X500ML | |
| Etanol | VWR, Radnor, EUA | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | F7524 | FCS deve ser testado para cultura de células Schwann |
| Fórceps fino (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 11252-20 | |
| Fórceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | F6886-10MG | |
| Gelatina | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | G1393-20ML | |
| Gentamicina | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | 5710064 | |
| IgG anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | A11036 | |
| IgG anti-coelho para cabras Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | A11001 | |
| HBSS (sem Ca2+ e sem Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| Incubadora HERAcell | Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| Soro para cavalos | Pan-Biotech, Aidenbach, Alemanha | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, EUA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | L2020-1MG | |
| Leibovitz&agudo; s L-15 Medium Thermo | Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| L-Glutamina 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 15000-08 | |
| Microscópio | Motic, Wetzlar, Alemanha | Motic BA 400 | |
| Microscópio Axio observador 7 | Zeiss, Oberkochen, Alemanha | 491917-0001-000 | |
| Lâmina de microscópio | VWR, Radnor, EUA | 630-1985 | |
| Separador MiniMACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130091632 | |
| colunas MS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-042-201 | |
| Câmara de contagem Neubauer | Assistente, Erlangen, Alemanha | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, EUA | 100-03 | |
| Meio neurobasal | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | N1408 | |
| Soro de cabra normal | Biozol, Eching, Alemanha | S-1000 | |
| Nunclon Δ multiplacas, 4 poços | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | D6789 | |
| Paraformaldeído | Acros Organics, Nova Jersey, EUA | ||
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 4430000018 | |
| Pipetas | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lisina | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | P4707-50ML | |
| Tubos de reação, 15 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Tubos de reação, 50 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Vasos de reação, 1,5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Armário de Segurança S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 14083-08 | |
| Pipeta sorológica, 10 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Pipeta sorológica, 25 mL | de Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Pipeta sorológica, 5 mL | de Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 10094-13 | |
| Descoberta de Estereomicroscópio.V8 | Zeiss, Oberkochen, Alemanha | 495015-0012-000 | |
| Tesoura cirúrgica | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha | 14007-14 | |
| TC prato 100, célula + | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| prato TC 35, célula + | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| prato TC 60, célula + | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | ||
| Thy-1 Microesferas (Kit MACS) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solução 0,4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | ||
| Tripsina (2,5%), sem fenol vermelho | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | 15090-046 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha | 25300-054 | |
| Tipo I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha | C1639 | |
| Banho-maria tipo 1008 | GFL, Burgwedel, Alemanha | Nº 4285 |
Referências
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
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Reimpressões e permissões
