in vitro myelinisering av perifere aksoner i en kokultur av rotte dorsalrot ganglion eksplanter og Schwann-celler

Summary

I kokultursystemet av dorsale rotganglier og Schwann-celler kan myelinisering av det perifere nervesystemet studeres. Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å observere og kvantifisere perifer myelinisering og å studere effekten av forbindelser av interesse på myelinskjeden.

Abstract

Myeliniseringsprosessen er avgjørende for å muliggjøre rask og tilstrekkelig signaltransduksjon i nervesystemet. I det perifere nervesystemet engasjerer nevroner og Schwann-celler seg i en kompleks interaksjon for å kontrollere myeliniseringen av axoner. Forstyrrelser av denne interaksjonen og nedbrytningen av myelinskjeden er kjennetegn ved inflammatoriske nevropatier og forekommer sekundært i nevrodegenerative lidelser. Her presenterer vi en kokulturmodell av dorsale rotganglioneksplanter og Schwann-celler, som utvikler en robust myelinisering av perifere aksoner for å undersøke myeliniseringsprosessen i det perifere nervesystemet, studere akson-Schwann-celleinteraksjoner og evaluere potensielle effekter av terapeutiske midler på hver celletype separat. Metodologisk ble dorsale rotganglioner av embryonale rotter (E13.5) høstet, dissosiert fra deres omkringliggende vev og dyrket som hele eksplanter i 3 dager. Schwann-celler ble isolert fra 3 uker gamle voksne rotter, og isjiasnervene ble enzymatisk fordøyd. De resulterende Schwann-cellene ble renset ved magnetisk aktivert cellesortering og dyrket under neuregulin og forskolinberikede forhold. Etter 3 dager med dorsalrotganglion-eksplantkultur ble 30 000 Schwann-celler tilsatt til en dorsalrotganglion-eksplant i et medium inneholdende askorbinsyre. De første tegn til myelinisering ble påvist dag 10 i kokultur, gjennom spredte signaler for myelinbasisk protein i immuncytokjemisk farging. Fra dag 14 og fremover ble myelinskjede dannet og forplantet langs aksonene. Myelinisering kan kvantifiseres ved myelinbasisk proteinfarging som et forhold mellom myeliniseringsområdet og aksonområdet, for å ta hensyn til forskjellene i aksonal tetthet. Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å studere ulike aspekter ved perifer myelinisering in vitro, noe som er avgjørende for å forstå patologien til og mulige behandlingsmuligheter for demyelinisering og nevrodegenerasjon ved inflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer i det perifere nervesystemet.

Introduction

I det perifere nervesystemet (PNS) medieres rask informasjonstransduksjon av myelininnpakkede aksoner. Myeliniseringen av aksoner er avgjørende for å muliggjøre rask forplantning av elektriske impulser, siden ledningshastigheten til nervefibrene korrelerer med aksondiameteren og myelintykkelsen¹. Sensorisk signalering fra periferien til sentralnervesystemet (CNS) er avhengig av aktivering av førsteordens sensoriske nevroner som ligger i utvidelser av dorsalroten, kalt dorsalrotganglier (DRG). For dannelse og vedlikehold av myelin, er kontinuerlig kommunikasjon mellom aksoner og Schwann-celler, som er de myeliniserende Glia-cellene i PNS, obligatorisk².

Mange sykdommer i PNS forstyrrer transduksjonen av informasjon ved enten primær aksonal eller demyeliniserende skade, noe som resulterer i hypestesi eller dysestesi. Førsteordens sensoriske nevroner har evnen til å regenerere i en grad etter nevronskader, ved et komplekst samspill mellom nevronet og omkringliggende Schwann-celler³. I dette tilfellet kan Schwann-celler gjennomgå cellulær omprogrammering for å fjerne aksonalt så vel som myelinrester og fremme aksonal regenerering, noe som resulterer i remyelinisering⁴. Å forstå mekanismene for myelinisering i helse og sykdom er viktig for å finne mulige behandlingsalternativer for demyeliniserende lidelser i PNS. Myelin kan også bli skadet av akutt nevrotrauma, og tilnærminger for å fremme myelinisering for å fremme funksjonell gjenoppretting etter perifer nerveskade er under utredning⁵.

Vår kunnskap om perifer myelinisering har i stor grad dratt nytte av myeliniserende kokulturer av Schwann-celler og sensoriske nevroner. Siden de første tilnærmingene ble brukt ^6,7,8, har myelinisering blitt studert intenst med bruk av forskjellige kokultursystemer^9,10,11. Her gir vi en rask og enkel protokoll for robust in vitro myelinisering av dorsale ganglionaksoner. Protokollen for Schwann-cellepreparering er basert på protokollen til Andersen et al.12, tidligere publisert i Pitarokoili et ^al.13. Vi bruker Schwann-celler avledet fra unge rotter og embryonale DRG-eksplantkulturer for kokulturen, der myelinisering skjer rundt dag 14. Målet med metoden er å gi et system for å undersøke dannelsen av myelin som et resultat av direkte akson-Schwann-celleinteraksjon, og å studere modulatorer av PNS myelinisering. I forhold til dissosierte nevroncellekulturer er DRG-eksplanter mer anatomisk bevart og danner lange aksonale prosesser. Kvantifisering av det myeliniserte aksonarealet gir en tilstrekkelig avlesning for myelinisering i kokulturen. Metoden er et verdifullt verktøy for å screene terapeutiske forbindelser for deres potensielle effekt på PNS-myelinisering, og kan også brukes i tillegg til in vivo-studier i dyremodeller¹⁴.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med De europeiske fellesskaps rådsdirektiv for stell og bruk av forsøksdyr. 1. Schwann cellekultur Belegg for Schwann cellekulturBelegg cellekulturfatene under sterile forhold. Påfør 2 ml 0,01 % poly-L-lysin (PLL) på to 60 mm vevskulturretter (TC) hver og rug over natten ved 4 °C. Fjern PLL, vask TC-oppvasken 2x med destillert vann og inkuber med 2 ml 1 μg/cm2 laminin over natten ved 4 °C. V…

Representative Results

Myelinisering i kokulturen ble vurdert på dagene 10, 12, 14, 16, 18 og 20. DRG-eksplantene og Schwann-cellene ble farget for MBP, βIII-tubulin og DAPI. Det aksonale nettverket i kokulturen var tett og endret seg ikke synlig i løpet av observasjonen. De første tegnene på myelin, i form av små fragmenter, kunne påvises dag 10 og økte dag 12 (figur 2). De MBP-positive områdene økte over tid frem til dag 20 i kulturen. Myeliniseringen ble kvantifisert som et forhold mellom de positive …

Discussion

Her presenterer vi en rask og lettvint protokoll for generering av in vitro myelinisering ved å slå sammen to separate celletypekulturer, Schwann-celler og dorsale rotganglioneksplanter.

Et kritisk trinn i protokollen er dyrking av DRG-eksplanter, spesielt i kulturens første dager. DRG er svært skjøre før et sterkt aksonalt nettverk er bygget og må håndteres svært nøye, for eksempel når det tas ut av inkubatoren eller under skifte av medium. DRG som løsner fra bunnen av br…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285