Celkweektechnieken en -praktijken om besmetting door schimmels en bacteriën in het laboratorium voor onderzoekscelkweek te voorkomen

Summary

Dit protocol presenteert essentiële celkweektechnieken en -praktijken die in het laboratorium voor onderzoekscelkweek moeten worden gebruikt om besmetting door schimmels en bacteriën te voorkomen. Binnen de categorie bacteriën zal speciale nadruk worden gelegd op het voorkomen van mycoplasmabesmetting.

Abstract

Celkweek is een delicate vaardigheid die nodig is voor het kweken van menselijke, dierlijke en insectencellen, of andere weefsels, in een gecontroleerde omgeving. Het doel van het protocol is om de nadruk te leggen op de juiste technieken die in een onderzoekslaboratorium worden gebruikt om besmetting door schimmels en bacteriën te voorkomen. Speciale nadruk wordt gelegd op het vermijden van mycoplasmabesmetting, een groot probleem in de celkweekruimte vanwege de kleine omvang en resistentie tegen de meeste antibiotica die worden gebruikt voor celkweek. Deze zelfde technieken zorgen voor continue groei en behoud van gezonde cellen. Voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers van celculturen is het belangrijk om zich consequent aan deze best practices te houden om het risico op besmetting te beperken. Eens per jaar moeten laboratoria de beste praktijken voor celkweek evalueren en indien nodig een discussie of aanvullende training volgen. Het nemen van vroege actie om besmetting in de eerste plaats te voorkomen, bespaart tijd en geld, in vergelijking met opruimen nadat besmetting is opgetreden. Universele best practices houden celculturen gezond, waardoor de noodzaak om voortdurend nieuwe cellen te ontdooien, dure celkweekmedia aan te schaffen en de hoeveelheid decontaminatie en downtime van de incubator wordt verminderd.

Introduction

Celkweek heeft vele toepassingen in het onderzoekslaboratorium. Sinds de oorsprong van celcultuur in het begin van de 20e eeuw hebben cellijnen de wetenschap vooruit geholpen. Cellijnen hebben verschillende voordelen; Verschillende cellijnen kunnen onderzoekers helpen celbiologie te bestuderen, baculovirus te produceren voor verdere studies of grote hoeveelheden van een interessant eiwit te produceren, om er maar een paar^{te noemen 1}. Enkele aanvullende toepassingen zijn het bestuderen van weefselgroei, het helpen bevorderen van vaccinontwikkeling, toxicologisch onderzoek, het bestuderen van de rol van genen in gezonde organismen en zieke modellen, en de productie van hybride cellijnen ^2,3. Cellijnen kunnen ook de productie van geneesmiddelen mogelijk maken³. Goede aseptische technieken zijn noodzakelijk bij het werken met cellijnen; De praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, zijn van toepassing op onderzoekslaboratoria waar celkweekwerk wordt uitgevoerd. Andere laboratoriumomgevingen worden niet besproken.

Contaminatie is vaak de primaire zorg bij het uitvoeren van celkweekwerk. In de context van dit artikel verwijst besmetting over het algemeen naar schimmels en bacteriën. Het algemene doel van de methode die in dit artikel wordt beschreven, is om de beste praktijken voor het voorkomen van besmetting grondig te beschrijven. Alle laboratoriumleden moeten zich aan deze praktijken houden wanneer ze in de celkweekruimte van een onderzoekslaboratorium werken. Laboratoria moeten ervoor zorgen dat alle werknemers actief deelnemen aan het gebruik van deze beste praktijken om besmetting te voorkomen. De kennis van de juiste praktijken en technieken zal helpen ervoor te zorgen dat celculturen levensvatbaar, gezond en vrij van besmetting blijven. De ontwikkeling van deze techniek is gebaseerd op literatuuronderzoek, zeven jaar ervaring met celculturen en de behoefte aan een methode waar zowel beginners als ervaren celkweekwerkers jaarlijks naar kunnen verwijzen.

Er is behoefte aan een duidelijke, gestandaardiseerde techniek die alle onderzoekscelkweeklaboratoria moeten volgen. Veel van de literatuur over celkweekbesmetting bespreekt de detectie van mycoplasma, aseptische technieken, bronnen van besmetting, eliminatie van verontreinigingen en preventie door het gebruik van antibiotica en regelmatige tests 4,5,6,7,8. Hoewel deze informatie nuttig is, zijn er geen video’s aanwezig in de literatuur die de juiste celkweektechnieken demonstreren die men moet volgen. Het voordeel van de gepresenteerde praktijken ten opzichte van alternatieve technieken is een focus op het voorkomen van besmetting voordat het gebeurt, in plaats van het later detecteren en corrigeren van fouten. Bovendien zijn een grondige demonstratie van aseptische technieken, een discussie over het voorkomen van schimmels en bacteriegroei en informatie over de luchtstroom van bioveiligheidskasten waardevol voor zowel beginnende als ervaren celkweekwerkers.

Bacteriën en schimmels zijn de twee meest voorkomende soorten verontreinigingen. Binnen de categorie bacteriën is mycoplasma een grote zorg vanwege zijn kleine omvang en het vermogen om zich te vermenigvuldigen terwijl het onopgemerkt blijft. Het zijn zelfreplicerende organismen zonder stijve celwand die afhankelijk zijn van eukaryote cellen om te groeien. Ze hebben verminderde metabolische mogelijkheden en kunnen zich sterk vermenigvuldigen terwijl ze niet worden herkend in de routinematige visuele inspectie van celculturen en regelmatige microscopische analyse, hoewel transmissie-elektronenmicroscopie mycoplasma ^9,10 kan detecteren. Bovendien kunnen ze door microbiologische filters^{gaan 10}. Celkweekmedium voorziet mycoplasma van voedingsstoffen, hoewel het aanvullen van media met antibiotica helaas geen invloed heeft op mycoplasma¹⁰. Men moet opmerken dat het in het algemeen niet nodig is om media aan te vullen met antibiotica; Goede technieken moeten volstaan om besmetting op afstand te houden. Infectie met mycoplasma leidt niet tot onmiddellijke celdood, maar het is zorgwekkend voor onderzoekers omdat het de reproduceerbaarheid en kwaliteit van gegevens beïnvloedt.

Al het laboratoriumpersoneel moet zich strikt houden aan goede celkweekpraktijken. Culturen moeten worden getest op mycoplasma nadat ze nieuw zijn gekocht, terwijl ze momenteel worden gekweekt, vóór cryopreservatie en wanneer ontdooid uit vloeibare stikstof ^2,10. Er zijn verschillende tests op de markt beschikbaar met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of immunostaining. ³ De literatuur geeft aan dat “menselijke isolaten een groot percentage van de mycoplasmaverontreinigingen vertegenwoordigen die in celculturen worden aangetroffen”⁵. Hoewel meer dan 200 mycoplasma-soorten zijn beschreven, zijn ongeveer zes hiervan verantwoordelijk voor de meeste infecties. Deze zes soorten zijn M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale en Acholeplasma laidlawii¹⁰. Net als bij andere soorten verontreiniging brengen lucht en aerosolen deze in celculturen⁵. Dit wordt herhaald in andere artikelen, aangezien de “menselijke operator potentieel het grootste gevaar in het laboratorium is”⁷. Hoewel dit gebeurt door menselijke fouten, kan het risico worden geëlimineerd als een standaardprocedure wordt gevolgd. Het afstoten van personeel is niet beperkt tot alleen mycoplasmabesmetting; Celculturen in het ene laboratorium zijn meestal geïnfecteerd met dezelfde mycoplasma-soort, wat aangeeft dat besmetting zich van de ene kolf naar de andere verspreidt als gevolg van onjuiste celkweektechnieken¹⁰.

Het voorkomen van kruisbesmetting is ook een andere reden waarom de juiste celkweektechnieken moeten worden gevolgd. Opgemerkt wordt dat ten minste 15% -18% van de cellijnen wereldwijd kruisbesmet of verkeerd geïdentificeerd kan zijn^11,12. Naast het testen van cellijnen op mycoplasmabesmetting, moeten ze ook worden getest op kruisbesmetting¹⁰. Voor menselijke cellijnen is cellijnauthenticatie door een goedkope DNA-gebaseerde techniek genaamd short tandem repeat (STR) -profilering de huidige internationale referentiestandaard, omdat het een eenvoudige manier is om cellijnidentiteit 2,10,13,14 te bevestigen. STR kan verkeerd gelabelde of kruisbesmette cellijnen identificeren, maar het kan geen onjuiste weefseloorsprong detecteren^10,13,14. De validiteit van onderzoeksgegevens kan in het gedrang komen als cellijnen verkeerd zijn gelabeld, verkeerd zijn geïdentificeerd of besmet¹³. Net als bij andere soorten verontreiniging kan kruisbesmetting optreden als gevolg van een slechte techniek waardoor aerosolen zich verspreiden, verkeerd contact waardoor het verkeerde celtype een kolf binnendringt, of het gebruik van dezelfde mediafles en reagentia met verschillende cellijnen¹⁰. Er mag geen mediaflessen worden gedeeld; Door één fles media tussen twee verschillende cellijnen te delen, kunnen die celpopulaties worden gemengd, waardoor het sneller groeiende celtype de kolf volledig overneemt. Deze vervanging is niet merkbaar en leidt tot verkeerde etikettering en verkeerde identificatie². Een cellijn kan ook voor een andere worden aangezien als culturen worden verward tijdens het hanteren of labelen¹⁰. Er moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan het gescheiden houden van reagentia, media en kolven. Elk lablid moet zijn eigen mediaflessen hebben; Er mag geen uitwisseling plaatsvinden tussen lableden. Cellijnen zelf moeten worden gekocht bij een gekwalificeerde celbank en provider. Laboratoria mogen geen cellen delen. Studies tonen aan dat, hoewel STR- en mycoplasmatests regelmatig worden gebruikt, veel onderzoeksartikelen in de literatuur al verkeerd geïdentificeerde of besmette cellijnen hebben gebruikt¹⁵. Het doorzoeken van het onderzoek om deze problematische artikelen te vinden en lezers met terugwerkende kracht over deze kwestie te informeren, is omslachtig. Preventie is de beste manier om ervoor te zorgen dat dit probleem zich in de eerste plaats niet voordoet.

De eenvoudige werking van het spuiten van items met 70% EtOH kan organismen doden; 70% EtOH werkt door eiwitten te denatureren en lipiden op te lossen in de meest vervuilende organismen, waaronder bacteriën en schimmels¹⁶. Studies hebben aangetoond dat 70% de meest effectieve concentratie is; oppervlakte-eiwitten stollen niet snel met 70% EtOH zodat ze de cel kunnen binnendringen, terwijl het water dat het bevat nodig is voor het denatureringsproces van eiwitten. Door het concentratieverschil van water en alcohol aan weerszijden van de celwand komt 70% EtOH de cel binnen om zowel enzymatische als structurele eiwitten te denatureren. Als schimmelgroei in kolven wordt waargenomen, moet de hele broedmachine worden ontsmet door deze eerst met 70% EtOH te besproeien en droog te vegen, gevolgd door een incubatie van 16 uur ‘s nachts bij 60 °C¹⁷. Dit doodt de meeste schimmels en eventuele bacteriën.

Het belangrijkste voordeel van preventiepraktijken ten opzichte van alternatieve technieken om besmetting te elimineren nadat deze zich heeft voorgedaan, is dat door besmetting vroegtijdig te voorkomen, laboratoriummedewerkers er zeker van kunnen zijn dat hun celculturen gezond zijn en dat er geen hoge kosten verbonden zijn aan de decontaminatie van incubators of het weggooien van celculturen. De eliminatie van mycoplasmaverontreinigingen daarna is bijvoorbeeld niet efficiënt⁷. Door in een vroeg stadium de tijd te nemen om ervoor te zorgen dat laboratoriumpersoneel goed is opgeleid, de celkweekruimte op zichzelf staat en een standaardprocedure wordt gebruikt, bespaart u tijd en geld.

Protocol

1. Voorbereidingen AlgemeenDraag een schone laboratoriumjas die alleen in de celkweekruimte en niet in andere delen van het laboratorium mag worden gedragen.OPMERKING: De laboratoriumjas hoeft niet steriel te zijn. Draag nieuwe handschoenen die geen andere oppervlakken hebben aangeraakt. Zorg ervoor dat de handschoenen goed aansluiten. Nitril, poedervrije handschoenen zijn het beste.OPMERKING: De handschoenen hoeven niet steriel te zijn. Om u voor te berei…

Representative Results

Als de juiste celkweektechnieken en -praktijken die in dit artikel worden beschreven niet worden gevolgd, kan besmetting door schimmels en bacteriën optreden in het laboratorium voor onderzoekscelkweek. Figuur 2 toont kolven met verontreiniging in zowel de suspensie- als de aanhangende cultuur. Wanneer u geen aseptische technieken volgt, kan schimmelverontreiniging 2-3 dagen later optreden. Ronde wazige ballen die in de media zweven, zijn merkbaar in suspensiecel…

Discussion

Hoewel besmetting een van de belangrijkste zorgen is bij het uitvoeren van celkweekwerk, zullen de praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, helpen de risico’s te beperken. De kritieke stappen omvatten het dragen van een schone laboratoriumjas, die alleen wordt gebruikt in de celkweekruimte, met behulp van schone, poedervrije handschoenen die vaak met 70% EtOH worden besproeid en die worden vervangen bij het schakelen tussen cellijnen, het aanmoedigen van elk individu om geen mediaflessen te delen…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques