Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

Summary

Ce protocole présente les techniques et pratiques essentielles de culture cellulaire à utiliser dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries. Dans la catégorie des bactéries, un accent particulier sera mis sur la prévention de la contamination par les mycoplasmes.

Abstract

La culture cellulaire est une compétence délicate nécessaire à la culture de cellules humaines, animales et d’insectes, ou d’autres tissus, dans un environnement contrôlé. L’objectif du protocole est de mettre l’accent sur les techniques correctes utilisées dans un laboratoire de recherche pour prévenir la contamination par des champignons et des bactéries. Un accent particulier est mis sur l’évitement de la contamination par les mycoplasmes, une préoccupation majeure dans la salle de culture cellulaire en raison de sa petite taille et de sa résistance à la plupart des antibiotiques utilisés pour la culture cellulaire. Ces mêmes techniques assurent une croissance continue et maintiennent des cellules saines. Pour les utilisateurs de cultures cellulaires débutants et expérimentés, il est important d’adhérer systématiquement à ces meilleures pratiques pour atténuer le risque de contamination. Une fois par année, les laboratoires devraient examiner les pratiques exemplaires en matière de culture cellulaire et faire un suivi avec une discussion ou une formation supplémentaire au besoin. Prendre des mesures précoces pour prévenir la contamination en premier lieu permettra d’économiser du temps et de l’argent, par rapport au nettoyage après la contamination. Les meilleures pratiques universelles maintiennent les cultures cellulaires en bonne santé, réduisant ainsi le besoin de décongeler constamment de nouvelles cellules, d’acheter des milieux de culture cellulaire coûteux et de réduire la quantité de décontamination et de temps d’arrêt de l’incubateur.

Introduction

La culture cellulaire a de nombreuses utilisations dans le laboratoire de recherche. Depuis les origines de la culture cellulaire au début du 20e siècle, les lignées cellulaires ont contribué à faire progresser la science. Les lignées cellulaires présentent plusieurs avantages; Diverses lignées cellulaires peuvent aider les chercheurs à étudier la biologie cellulaire, à produire des baculovirus pour des études plus approfondies ou à produire de grandes quantités d’une protéine d’intérêt, pour n’en nommer que^{quelques-unes 1}. Parmi les autres utilisations, mentionnons l’étude de la croissance tissulaire, l’aide à l’avancement de la mise au point de vaccins, la recherche en toxicologie, l’étude du rôle des gènes dans les organismes sains et les modèles malades, et la production de lignées cellulaires hybrides ^2,3. Les lignées cellulaires peuvent également permettre la production de médicaments³. Des techniques d’asepsie appropriées sont nécessaires lorsque vous travaillez avec des lignées cellulaires; Les pratiques et techniques décrites dans ce manuscrit sont applicables aux laboratoires de recherche où des travaux de culture cellulaire sont effectués. Les autres laboratoires ne sont pas abordés.

La contamination est souvent la principale préoccupation lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire. Dans le contexte du présent document, la contamination fait généralement référence aux champignons et aux bactéries. L’objectif global de la méthode décrite dans ce document est de décrire en détail les meilleures pratiques pour éviter la contamination. Tous les membres du laboratoire doivent adhérer à ces pratiques lorsqu’ils travaillent dans la salle de culture cellulaire d’un laboratoire de recherche. Les laboratoires devraient s’assurer que tous les travailleurs participent activement à l’utilisation de ces pratiques exemplaires pour prévenir la contamination. La connaissance des bonnes pratiques et techniques aidera à garantir que les cultures cellulaires restent viables, saines et exemptes de contamination. Le développement de cette technique est basé sur la recherche de la littérature, sept ans d’expérience de travail avec des cultures cellulaires et la nécessité d’une méthode à laquelle les novices et les travailleurs expérimentés en culture cellulaire peuvent se référer chaque année.

Il est nécessaire de mettre au point une technique claire et normalisée que tous les laboratoires de culture cellulaire de recherche devraient suivre. Une grande partie de la littérature sur la contamination par culture cellulaire traite de la détection des mycoplasmes, des techniques aseptiques, des sources de contamination, de l’élimination des contaminants et de la prévention par l’utilisation d’antibiotiques et des tests réguliers 4,5,6,7,8. Bien que cette information soit utile, il n’y a pas de vidéos présentes dans la littérature qui démontrent les techniques de culture cellulaire appropriées que l’on devrait suivre. L’avantage des pratiques présentées par rapport aux techniques alternatives est de mettre l’accent sur la prévention de la contamination avant qu’elle ne se produise, plutôt que de détecter et de corriger les erreurs plus tard. De plus, une démonstration approfondie des techniques d’asepsie, une discussion sur la prévention de la croissance des champignons et des bactéries et des informations sur la circulation de l’air des armoires de biosécurité sont précieuses pour les travailleurs novices et expérimentés en culture cellulaire.

Les bactéries et les champignons sont les deux types de contaminants les plus courants. Dans la catégorie des bactéries, les mycoplasmes sont une préoccupation majeure en raison de leur petite taille et de leur capacité à proliférer tout en restant inaperçus. Ce sont des organismes auto-réplicatifs sans paroi cellulaire rigide qui dépendent des cellules eucaryotes pour se développer. Ils ont des capacités métaboliques réduites et peuvent se multiplier considérablement tout en restant non reconnus dans l’inspection visuelle de routine des cultures cellulaires et l’analyse microscopique régulière, bien que la microscopie électronique à transmission puisse détecter les mycoplasmes ^9,10. De plus, ils peuvent passer à travers des filtres microbiologiques¹⁰. Le milieu de culture cellulaire fournit des nutriments aux mycoplasmes, bien que malheureusement la supplémentation en antibiotiques n’affecte pas les mycoplasmes¹⁰. Il convient de noter que, en général, il n’est pas nécessaire de compléter les milieux avec des antibiotiques; Des techniques appropriées devraient suffire à tenir la contamination à distance. L’infection par les mycoplasmes n’entraîne pas la mort cellulaire immédiate, mais elle préoccupe les chercheurs car elle affecte la reproductibilité et la qualité des données.

Tout le personnel de laboratoire doit adhérer strictement aux bonnes pratiques de culture cellulaire. Les cultures doivent être testées pour les mycoplasmes après leur nouvel achat, pendant leur culture, avant la cryoconservation et lorsqu’elles sont décongelées à partir d’azote liquide ^2,10. Différents tests sont disponibles sur le marché en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou l’immunomarquage. ³ La littérature indique que « les isolats humains représentent un pourcentage élevé des contaminants mycoplasmiques trouvés dans les cultures cellulaires »⁵. Bien que plus de 200 espèces de mycoplasmes aient été décrites, environ six d’entre elles représentent la plupart des infections. Ces six espèces sont M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale et Acholeplasma laidlawii¹⁰. Comme pour les autres types de contamination, l’air et les aérosols les introduisent dans les cultures cellulaires⁵. Cela se retrouve dans d’autres articles puisque « l’opérateur humain est potentiellement le plus grand danger en laboratoire »⁷. Bien que cela se fasse par erreur humaine, le risque peut être éliminé si une procédure standard est suivie. L’excrétion du personnel ne se limite pas à la contamination par les mycoplasmes; Les cultures cellulaires dans un laboratoire sont généralement infectées par les mêmes espèces de mycoplasmes, ce qui indique que la contamination se propage d’un flacon à l’autre en raison de techniques de culture cellulaire inappropriées¹⁰.

La prévention de la contamination croisée est également une autre raison pour laquelle les techniques de culture cellulaire appropriées doivent être suivies. Il est à noter qu’au moins 15 % à 18 % des lignées cellulaires dans le monde peuvent être contaminées ou mal identifiées^11,12. En plus de tester les lignées cellulaires pour la contamination par les mycoplasmes, elles devraient également être testées pour la contamination croisée¹⁰. Pour les lignées cellulaires humaines, l’authentification des lignées cellulaires par une technique peu coûteuse basée sur l’ADN appelée profilage à courte répétition en tandem (STR) est la norme de référence internationale actuelle, car c’est un moyen facile de confirmer l’identité de la lignée cellulaire 2,10,13,14. STR peut identifier les lignées cellulaires mal étiquetées ou contaminées par des croix, mais il ne peut pas détecter l’origine tissulaire incorrecte^10,13,14. La validité des données de recherche peut être compromise si les lignées cellulaires sont mal étiquetées, mal identifiées ou contaminées¹³. Comme pour d’autres types de contamination, la contamination croisée peut se produire en raison d’une mauvaise technique provoquant la propagation des aérosols, d’un contact erroné conduisant au mauvais type de cellule entrant dans un flacon ou de l’utilisation du même flacon de média et des mêmes réactifs avec des lignées cellulaires différentes¹⁰. Aucun partage de bouteilles multimédias ne devrait avoir lieu; Le partage d’une bouteille de média entre deux lignées cellulaires différentes peut permettre à ces populations cellulaires d’être mélangées, ce qui conduit le type cellulaire à croissance plus rapide à prendre complètement le contrôle du flacon. Ce remplacement n’est pas perceptible et entraîne des erreurs d’étiquetage et d’identification². Une lignée cellulaire peut également être confondue avec une autre si les cultures sont confondues lors de la manipulation ou de l’étiquetage¹⁰. Une attention particulière doit être accordée à garder les réactifs, les milieux et les flacons séparés les uns des autres. Chaque membre du laboratoire devrait avoir ses propres flacons médias; Aucun partage ne doit avoir lieu entre les membres du laboratoire. Les lignées cellulaires elles-mêmes doivent être achetées auprès d’une banque de cellules et d’un fournisseur qualifiés. Les laboratoires ne devraient pas partager de cellules. Des études montrent que, bien que les tests STR et mycoplasmes soient régulièrement utilisés, de nombreux articles de recherche dans la littérature ont déjà utilisé des lignées cellulaires mal identifiées ou contaminées¹⁵. Passer au crible la recherche pour trouver ces articles problématiques et informer rétroactivement les lecteurs à ce sujet est fastidieux. La prévention est le meilleur moyen de s’assurer que ce problème ne se produise pas en premier lieu.

La simple action de pulvériser des articles avec 70% d’EtOH peut tuer les organismes; 70% EtOH agit en dénaturant les protéines et en dissolvant les lipides dans les organismes les plus fréquemment contaminants, y compris les bactéries et les champignons¹⁶. Des études ont montré que 70% est la concentration la plus efficace; Les protéines de surface ne coagulent pas rapidement avec 70% d’EtOH afin qu’elles puissent pénétrer dans la cellule, tandis que l’eau qu’elle contient est nécessaire au processus de dénaturation des protéines. En raison de la différence de concentration d’eau et d’alcool de chaque côté de la paroi cellulaire, 70% d’EtOH pénètre dans la cellule pour dénaturer les protéines enzymatiques et structurelles. Si la croissance de moisissures est observée dans les flacons, l’ensemble de l’incubateur doit être décontaminé en le pulvérisant d’abord avec 70% d’EtOH et en l’essuyant, suivi d’une incubation nocturne de 16 heures à 60 °C¹⁷. Cela tue la plupart des moisissures et des bactéries.

Le principal avantage des pratiques de prévention par rapport aux techniques alternatives d’élimination de la contamination après qu’elle se soit produite est qu’en prévenant la contamination dès le début, les travailleurs de laboratoire peuvent être sûrs que leurs cultures cellulaires sont saines et qu’il n’y aura pas de coûts élevés associés à la décontamination des incubateurs ou à la mise au rebut des cultures cellulaires. L’élimination des contaminants mycoplasmiques après, par exemple, n’est pas efficace⁷. Prendre le temps dès le début de s’assurer que le personnel de laboratoire est correctement formé, que la salle de culture cellulaire est autonome et qu’une procédure standard est utilisée permettra d’économiser du temps et de l’argent.

Protocol

1. Préparatifs GénéralitésPortez une blouse de laboratoire propre conçue pour être portée uniquement dans la salle de culture cellulaire et dans aucune autre partie du laboratoire.REMARQUE: La blouse de laboratoire n’a pas besoin d’être stérile. Portez des gants neufs qui n’ont touché aucune autre surface. Assurez-vous que les gants sont bien ajustés. Les gants en nitrile sans poudre sont les meilleurs.REMARQUE: Les gants n’ont pas besoin d’être…

Representative Results

Si les techniques et les pratiques de culture cellulaire décrites dans le présent document ne sont pas suivies, la contamination par des champignons et des bactéries peut se produire dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche. La figure 2 montre les flacons contaminés à la fois dans les cultures en suspension et adhérentes. Lorsqu’il ne suit pas les techniques d’asepsie, la contamination par les moisissures peut survenir 2 à 3 jours plus tar…

Discussion

Bien que la contamination soit l’une des principales préoccupations lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire, les pratiques et les techniques décrites dans ce manuscrit aideront à atténuer les risques. Les étapes critiques comprennent le port d’une blouse de laboratoire propre, qui n’est utilisée que dans la salle de culture cellulaire, l’utilisation de gants propres et sans poudre qui sont souvent pulvérisés avec 70% d’EtOH et qui sont changés lors du passage d’une lignée cellulaire …

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques