研究細胞培養実験室における真菌や細菌による汚染を回避するための細胞培養技術と実践

Summary

このプロトコルは、真菌や細菌による汚染を避けるために研究細胞培養ラボで使用される重要な細胞培養技術と実践を提示します。細菌のカテゴリー内では、マイコプラズマ汚染の防止に特に重点が置かれます。

Abstract

細胞培養は、制御された環境でヒト、動物、昆虫の細胞、またはその他の組織を成長させるために必要な繊細なスキルです。プロトコルの目的は、真菌や細菌による汚染を防ぐために研究室で使用される正しい技術を強調することです。特に、サイズが小さいため、細胞培養室で大きな懸念事項であるマイコプラズマ汚染の回避に重点が置かれており、細胞培養に使用されるほとんどの抗生物質に対する耐性があります。これらの同じ技術は、継続的な成長を保証し、健康な細胞を維持します。新規および経験豊富な細胞培養ユーザーにとって、汚染のリスクを軽減するために、これらのベストプラクティスを一貫して遵守することが重要です。年に一度、ラボは細胞培養のベストプラクティスを確認し、必要に応じてディスカッションまたは追加のトレーニングでフォローアップする必要があります。そもそも汚染を防ぐための早期の行動を取ることは、汚染が発生した後のクリーンアップと比較して、時間とお金を節約できます。普遍的なベストプラクティスは、細胞培養を健康に保ち、それによって新しい細胞を絶えず解凍し、高価な細胞培養培地を購入する必要性を減らし、インキュベーターの除染とダウンタイムの量を減らします。

Introduction

細胞培養は研究室で多くの用途があります。20世紀初頭の細胞培養の起源以来、細胞株は科学の進歩に貢献してきました。細胞株にはいくつかの利点があります。さまざまな細胞株は、研究者が細胞生物学を研究したり、さらなる研究のためにバキュロウイルスを産生したり、目的のタンパク質を大量に産生したりするのに役立ちます^。その他の用途には、組織成長の研究、ワクチン開発の進歩の支援、毒物学研究、健康な生物および疾患モデルにおける遺伝子の役割の研究、ハイブリッド細胞株の製造などがあります^2,3。細胞株は医薬品製造も可能にします³。細胞株を扱う際には、適切な無菌技術が必要です。この原稿で概説されている実践と技術は、細胞培養作業が行われる研究所に適用できます。他の実験室の設定については説明しません。

細胞培養作業を行う際には、汚染が主な懸念事項であることがよくあります。この論文の文脈では、汚染は一般的に真菌とバクテリアを指します。このホワイト ペーパーで概説されている方法の全体的な目標は、汚染を回避するためのベスト プラクティスを徹底的に説明することです。すべてのラボメンバーは、ラボの細胞培養室で作業する際にこれらの慣行を遵守する必要があります。研究所は、すべての労働者が汚染を防ぐためにこれらのベストプラクティスを使用することに積極的に参加していることを確認する必要があります。正しい実践と技術の知識は、細胞培養が生存可能で健康であり、汚染のない状態を維持するのに役立ちます。この技術の開発は、文献の研究、細胞培養での7年の経験、および初心者と経験豊富な細胞培養労働者の両方が毎年参照できる方法の必要性に基づいています。

すべての研究細胞培養ラボが従うべき明確で標準化された技術が必要です。細胞培養汚染に関する文献の多くは、マイコプラズマの検出、無菌技術、汚染源、汚染物質の除去、抗生物質の使用による予防、および定期的な検査について説明しています^4,5,6,7,8。この情報は役に立ちますが、従うべき適切な細胞培養技術を示すビデオは文献に存在しません。代替技術よりも提示された慣行の利点は、後で間違いを検出して修正するのではなく、汚染が発生する前に防止することに重点を置いていることです。さらに、無菌技術の徹底的なデモンストレーション、真菌や細菌の増殖防止に関する議論、およびバイオセーフティキャビネットの気流に関する情報は、初心者と経験豊富な細胞培養作業員の両方にとって貴重です。

細菌と真菌は、最も一般的な2種類の汚染物質です。細菌のカテゴリーの中で、マイコプラズマは、そのサイズが小さく、気付かれずに増殖する能力があるため、大きな懸念事項です。それらは、真核細胞に依存して成長する硬い細胞壁を持たない自己複製生物です。透過型電子顕微鏡はマイコプラズマ^9,10を検出できますが、それらは代謝能力を低下させ、細胞培養の日常的な目視検査および定期的な顕微鏡分析では認識されないまま大きく増殖する可能性があります。また、微生物学的^{フィルター10}を通過できる。細胞培養培地はマイコプラズマに栄養素を提供しますが、残念ながら培地に抗生物質を補給してもマイコプラズマ¹⁰には影響しません。一般に、培地に抗生物質を補給する必要はないことに注意する必要があります。汚染を寄せ付けないようにするには、適切な技術で十分です。マイコプラズマの感染は即時の細胞死にはつながりませんが、データの再現性と品質に影響を与えるため、研究者にとっては懸念事項です。

すべてのラボ担当者は、適切な細胞培養慣行を厳守する必要があります。培養物は、新たに購入した後、現在栽培中、凍結保存前、および液体窒素^2,10から解凍したときに、マイコプラズマについてテストする必要があります。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、または免疫染色を使用したさまざまな検査が市場で入手可能です。³文献は、「ヒト分離株は、細胞培養で見つかったマイコプラズマ汚染物質の大部分を占める」ことを示しています⁵。200種以上のマイコプラズマ種が記載されているが、そのうち約6種がほとんどの感染症を占めている。これらの6種は、M. arginini、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. orale、およびAcholeplasma laidlawii¹⁰です。他の種類の汚染と同様に、空気とエアロゾルはこれらを細胞培養物に持ち込みます⁵。これは、「人間のオペレーターは実験室で潜在的に最大の危険である」⁷ため、他の論文にも反映されています。これは人為的ミスによって行われますが、標準的な手順に従えばリスクを排除できます。人員からの脱落は、マイコプラズマ汚染だけに限定されません。あるラボでの細胞培養は通常、同じマイコプラズマ種に感染しており、不適切な細胞培養技術のために汚染がフラスコから別のフラスコに広がっていることを示しています¹⁰。

交差汚染の防止も、適切な細胞培養技術に従うべきもう一つの理由です。世界中の細胞株の少なくとも15%〜18%が交差汚染または誤認されている可能性があることに注意してください^11,12。マイコプラズマ汚染について細胞株をテストすることに加えて、それらは交差汚染についてもテストする必要があります¹⁰。ヒト細胞株の場合、ショートタンデムリピート(STR)プロファイリングと呼ばれる安価なDNAベースの技術による細胞株認証は、細胞株の同一性を確認する簡単な方法であるため、現在の国際標準です2,10,13,14。STRは、誤ってラベル付けされた細胞株や交差汚染された細胞株を識別できますが、誤った組織起源を検出することはできません¹⁰、^13、14。細胞株が誤ってラベル付けされたり、誤って識別されたり、汚染されたりすると、研究データの妥当性が損なわれる可能性があります¹³。他のタイプのコンタミネーションと同様に、クロスコンタミネーションは、エアロゾルの拡散を引き起こす不十分な技術、フラスコに入る誤った細胞タイプにつながる誤った接触、または異なる細胞株を有する同じ培地ボトルおよび試薬の使用によって起こり得る¹⁰。メディアボトルの共有は行われません。2つの異なる細胞株間で1本の培地を共有することで、これらの細胞集団を混合することができ、成長の速い細胞タイプがフラスコを完全に引き継ぐことができます。この交換は目立たず、誤ったラベル付けと誤認につながります²。細胞株は、取り扱いまたは標識中に培養物が混同された場合、別の細胞株と間違われる可能性もあります¹⁰。試薬、培地、フラスコを互いに分離しておくことに細心の注意を払う必要があります。各ラボメンバーは、独自のメディアボトルを持っている必要があります。ラボ メンバー間での共有は行われません。細胞株自体は、資格のある細胞バンクおよびプロバイダーから購入する必要があります。実験室は細胞を共有するべきではありません。研究によると、STRおよびマイコプラズマ検査は定期的に使用されていますが、文献の多くの研究論文はすでに誤認または汚染された細胞株を使用しています¹⁵。これらの問題のある論文を見つけ、この問題について読者に遡及的に知らせるために研究をふるいにかけるのは面倒です。予防は、この問題が最初に発生しないようにするための最良の方法です。

アイテムに70%のEtOHをスプレーするという単純なアクションは、生物を殺すことができます。70%のEtOHは、細菌や真菌を含む最も一般的に汚染されている生物のタンパク質を変性させ、脂質を溶解することによって機能します¹⁶。研究によると、70%が最も効果的な濃度です。表面タンパク質は70%のEtOHで急速に凝固しないため、細胞に入ることができますが、表面タンパク質に含まれる水はタンパク質の変性プロセスに必要です。細胞壁の両側の水とアルコールの濃度差により、70%のEtOHが細胞に入り、酵素タンパク質と構造タンパク質の両方を変性させます。フラスコ内でカビの成長が観察された場合は、最初に70%EtOHを噴霧して拭いて乾かし、次に60°Cで16時間一晩インキュベートすることにより、インキュベーター全体を除染する必要があります¹⁷。これはほとんどのカビとバクテリアを殺します。

汚染発生後に汚染を除去する代替技術に対する予防慣行の主な利点は、汚染を早期に防止することにより、実験室の労働者は細胞培養が健康であることを確信でき、インキュベーターの除染や細胞培養物の廃棄に関連する高額なコストがかからないことです。たとえば、マイコプラズマ汚染物質の除去は効率的ではありません⁷。ラボ担当者が適切に訓練されていることを確認するために早い段階で時間をかけると、細胞培養室は自己完結型であり、標準的な手順が使用されるため、時間とお金を節約できます。

Protocol

1. 事前準備 全般細胞培養室でのみ着用するように指定された清潔な白衣を着用し、実験室の他の部分は着用しないでください。注意: 白衣は無菌である必要はありません。 他の表面に触れていない新しい手袋を着用してください。手袋がしっかりとフィットしていることを確認してください。ニトリル、パウダーフリーの手袋が最適です。注意: 手袋…

Representative Results

この論文で概説されている適切な細胞培養技術と慣行に従わないと、研究用細胞培養実験室で真菌や細菌による汚染が発生する可能性があります。 図2 は、懸濁培養物および付着培養物の両方における汚染を含むフラスコを示す。 無菌技術に従わない場合、カビの汚染は2〜3日後に発生する可能性があります。培地に浮遊する丸いぼやけたボールは…

Discussion

汚染は細胞培養作業を行う際の主な懸念事項の1つですが、この原稿で概説されている実践と技術はリスクを軽減するのに役立ちます。重要なステップには、細胞培養室でのみ使用される清潔な白衣の着用、70%EtOHを頻繁に噴霧し、細胞株を切り替えるときに交換される清潔で粉末を含まない手袋の使用、各個人に培地ボトルを共有しないように促すこと、作業終了の前後にキャビネットを徹?…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques