Summary

연구 세포 배양 실험실에서 곰팡이 및 박테리아에 의한 오염을 방지하기 위한 세포 배양 기술 및 관행

Published: July 07, 2023
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Summary

이 프로토콜은 곰팡이 및 박테리아에 의한 오염을 피하기 위해 연구 세포 배양 실험실에서 사용되는 필수 세포 배양 기술 및 관행을 제시합니다. 박테리아 범주 내에서 마이코플라스마 오염 방지에 특히 중점을 둘 것입니다.

Abstract

세포 배양은 통제된 환경에서 인간, 동물 및 곤충 세포 또는 기타 조직을 성장시키는 데 필요한 섬세한 기술입니다. 이 프로토콜의 목표는 곰팡이와 박테리아의 오염을 방지하기 위해 실험실에서 사용되는 올바른 기술을 강조하는 것입니다. 마이코플라스마 오염을 피하는 데 특히 중점을 두고 있는데, 이는 마이코플라스마의 크기가 작고 세포 배양에 사용되는 대부분의 항생제에 대한 내성으로 인해 세포 배양실의 주요 관심사입니다. 이러한 동일한 기술은 지속적인 성장을 보장하고 건강한 세포를 유지합니다. 신규 및 숙련된 세포 배양 사용자 모두에게 오염 위험을 완화하기 위해 이러한 모범 사례를 일관되게 준수하는 것이 중요합니다. 일년에 한 번, 실험실은 세포 배양 모범 사례를 검토하고 필요한 경우 토론 또는 추가 교육을 통해 후속 조치를 취해야 합니다. 애초에 오염을 방지하기 위한 조기 조치를 취하면 오염이 발생한 후 청소하는 것과 비교하여 시간과 비용을 절약할 수 있습니다. 보편적인 모범 사례는 세포 배양을 건강하게 유지하여 새로운 세포를 지속적으로 해동하고, 값비싼 세포 배양 배지를 구매하고, 인큐베이터 오염 제거 및 가동 중지 시간을 줄여야 할 필요성을 줄입니다.

Introduction

세포 배양은 연구실에서 많은 용도로 사용됩니다. 20세기 초 세포 배양의 기원 이후, 세포주는 과학을 발전시키는 데 도움이 되었습니다. 세포주에는 몇 가지 장점이 있습니다. 다양한 세포주는 연구자들이 세포 생물학을 연구하거나, 추가 연구를 위해 바큘로바이러스를 생산하거나, 관심 있는 단백질을 대량으로 생산하는 데 도움이 될 수 있습니다1. 일부 추가 용도로는 조직 성장 연구, 백신 개발 촉진, 독성학 연구, 건강한 유기체 및 질병 모델에서 유전자의 역할 연구, 하이브리드 세포주생산 등이 있습니다 2,3. 세포주는 또한 약물 생산을 가능하게 할 수 있다3. 세포주로 작업할 때 적절한 무균 기술이 필요합니다. 이 원고에 요약된 관행과 기술은 세포 배양 작업이 수행되는 연구 실험실에 적용할 수 있습니다. 다른 실험실 설정은 논의되지 않습니다.

오염은 종종 세포 배양 작업을 수행할 때 주요 관심사입니다. 이 논문의 맥락에서 오염은 일반적으로 곰팡이와 박테리아를 의미합니다. 이 백서에 설명된 방법의 전반적인 목표는 오염을 방지하기 위한 모범 사례를 철저히 설명하는 것입니다. 모든 실험실 구성원은 연구실의 세포 배양실에서 작업할 때 이러한 관행을 준수해야 합니다. 실험실은 모든 작업자가 오염을 방지하기 위해 이러한 모범 사례를 사용하는 데 적극적으로 참여하도록 해야 합니다. 올바른 관행과 기술에 대한 지식은 세포 배양이 생존 가능하고 건강하며 오염되지 않도록 하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 개발은 문헌 연구, 세포 배양 작업 7년 경험, 초보자와 숙련된 세포 배양 작업자 모두가 매년 참조할 수 있는 방법의 필요성을 기반으로 합니다.

모든 연구 세포 배양 실험실이 따라야 하는 명확하고 표준화된 기술이 필요합니다. 세포 배양 오염에 관한 많은 문헌은 마이코플라스마 검출, 무균 기술, 오염원, 오염 물질 제거, 항생제 사용 및 정기 검사에 의한 예방에 대해 논의합니다 4,5,6,7,8. 이 정보는 도움이 되지만 따라야 하는 적절한 세포 배양 기술을 보여주는 비디오는 문헌에 없습니다. 대체 기술에 비해 제시된 관행의 장점은 나중에 실수를 감지하고 수정하는 것이 아니라 오염이 발생하기 전에 예방하는 데 중점을 둔다는 것입니다. 또한 무균 기술에 대한 철저한 시연, 곰팡이 및 박테리아 성장 방지에 대한 논의, 생물 안전 캐비닛 공기 흐름에 관한 정보는 초보자와 숙련된 세포 배양 작업자 모두에게 가치가 있습니다.

박테리아와 곰팡이는 가장 흔한 두 가지 유형의 오염 물질입니다. 박테리아 범주 내에서 마이코플라스마는 크기가 작고 눈에 띄지 않으면서 증식할 수 있는 능력으로 인해 주요 관심사입니다. 그들은 성장하기 위해 진핵 세포에 의존하는 단단한 세포벽이 없는 자가 복제 유기체입니다. 투과 전자 현미경은 마이코 플라스마 9,10을 검출 할 수 있지만 세포 배양의 일상적인 육안 검사 및 정기적 인 현미경 분석에서 인식되지 않는 동안 대사 능력이 감소하고 크게 증식 할 수 있습니다. 또한, 미생물 필터10을 통과 할 수 있습니다. 세포 배양 배지는 마이코플라스마에 영양분을 공급하지만, 불행히도 배지에 항생제를 보충해도 마이코플라스마10에는 영향을 미치지 않습니다. 일반적으로 항생제로 배지를 보충 할 필요는 없습니다. 적절한 기술만으로도 오염을 막을 수 있습니다. 마이코플라스마 감염은 즉각적인 세포 사멸로 이어지지는 않지만 데이터 재현성과 품질에 영향을 미치기 때문에 연구자들에게는 우려스러운 일입니다.

모든 실험실 직원은 우수한 세포 배양 관행을 엄격히 준수해야 합니다. 배양균은 새로 구입한 후, 현재 재배 중인 동안, 냉동 보존 전, 액체 질소에서 해동할 때 마이코플라스마 검사를 받아야 합니다 2,10. 중합효소연쇄반응(PCR), 효소결합면역분석법(ELISA) 또는 면역염색을 사용하여 다양한 검사를 시중에서 구할 수 있습니다. 3 문헌은 “인간 분리주가 세포 배양에서 발견되는 마이코플라스마 오염 물질의 상당 부분을 차지한다”고 지적합니다.5. 200종 이상의 마이코플라스마 종이 기술되었지만 이 중 약 6종이 대부분의 감염을 차지합니다. 이 6 종은 M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale 및 Acholeplasma laidlawii10입니다. 다른 유형의 오염과 마찬가지로 공기와 에어로졸은 이를 세포 배양으로 가져옵니다5. 이것은 “인간 조작자가 실험실에서 잠재적으로 가장 큰 위험”이기 때문에 다른 논문에서도 반향을 일으킨다.7. 이것은 인적 오류를 통해 이루어 지지만 표준 절차를 따르면 위험을 제거 할 수 있습니다. 직원의 탈락은 마이코플라스마 오염에만 국한되지 않습니다. 한 실험실의 세포 배양은 일반적으로 동일한 마이코플라스마 종에 감염되며, 이는 부적절한 세포 배양 기술로 인해 오염이 한 플라스크에서 다른 플라스크로 퍼진다는 것을 나타낸다10.

교차 오염 방지는 적절한 세포 배양 기술을 따라야 하는 또 다른 이유입니다. 전 세계 세포주의 최소 15%-18%가 교차 오염되거나 잘못 식별될 수 있습니다11,12. 세포주에서 마이코플라스마 오염을 검사하는 것 외에도 교차 오염에 대해서도 검사해야 한다10. 인간 세포주의 경우, 짧은 직렬 반복(STR) 프로파일링이라고 하는 저렴한 DNA 기반 기술에 의한 세포주 인증은 세포주 동일성을 확인하는 쉬운 방법이기 때문에 현재 국제 참조 표준입니다 2,10,13,14. STR은 잘못 표지되거나 교차 오염된 세포주를 식별할 수 있지만, 잘못된 조직 기원을 검출할 수는 없다10,13,14. 세포주가 잘못 표시되거나, 잘못 식별되거나, 오염된 경우 연구 데이터의 유효성이 손상될 수 있다13. 다른 유형의 오염과 마찬가지로, 교차 오염은 에어로졸 확산을 유발하는 잘못된 기술, 잘못된 접촉으로 인해 잘못된 세포 유형이 플라스크에 들어가거나, 동일한 배지 병 및 시약을 다른 세포주와 함께 사용하기 때문에 발생할 수 있다10. 미디어 병을 공유해서는 안 됩니다. 두 개의 서로 다른 세포주 간에 배지 한 병을 공유하면 해당 세포 집단을 혼합할 수 있으므로 더 빠르게 성장하는 세포 유형이 플라스크를 완전히 장악할 수 있습니다. 이 교체는 눈에 띄지 않으며 잘못된 라벨링 및 오인으로 이어집니다2. 또한 배양 과정에서 배양이 혼동되는 경우 세포주를 다른 세포주로 오인할 수 있다10. 시약, 배지 및 플라스크를 서로 분리하는 데 세심한 주의를 기울여야 합니다. 각 실험실 구성원은 자신의 미디어 병을 가지고 있어야 합니다. 랩 구성원 간에 공유가 발생하지 않아야 합니다. 세포주 자체는 자격을 갖춘 세포 은행 및 공급자로부터 구입해야 합니다. 실험실은 세포를 공유해서는 안됩니다. 연구에 따르면, STR 검사와 마이코플라스마 검사가 정기적으로 사용되지만, 문헌에 실린 많은 연구 논문에서는 이미 잘못 식별되거나 오염된 세포주를 사용하고 있다15. 이러한 문제가 있는 논문을 찾고 독자들에게 이 문제에 대해 소급하여 알리기 위해 연구를 샅샅이 뒤지는 것은 번거로운 일입니다. 예방은 애초에 이 문제가 발생하지 않도록 하는 가장 좋은 방법입니다.

70% EtOH로 품목을 살포하는 간단한 행동은 유기체를 죽일 수 있습니다. 70% EtOH는 박테리아와 곰팡이를 포함하여 가장 흔하게 오염되는 유기체에서 단백질을 변성시키고 지질을 용해시키는 방식으로 작용한다16. 연구에 따르면 70%가 가장 효과적인 농도입니다. 표면 단백질은 70% EtOH로 빠르게 응고되지 않아 세포에 들어갈 수 있는 반면, 단백질에 포함된 물은 단백질의 변성 과정에 필요합니다. 세포벽의 양쪽에 있는 물과 알코올의 농도 차이로 인해 70% EtOH가 세포로 들어가 효소 및 구조 단백질을 모두 변성시킵니다. 플라스크에서 곰팡이 성장이 관찰되는 경우, 먼저 70% EtOH를 분무하고 닦아내어 건조시킨 다음 60°C에서 16시간 동안 배양하여 전체 인큐베이터를 오염 제거해야 합니다17. 이것은 대부분의 곰팡이와 박테리아를 죽입니다.

오염이 발생한 후 제거하는 대체 기술에 비해 예방 관행의 주요 이점은 오염을 조기에 방지함으로써 실험실 작업자가 세포 배양이 건강하다는 것을 확신할 수 있고 인큐베이터의 오염 제거 또는 세포 배양 폐기와 관련된 높은 비용이 발생하지 않는다는 것입니다. 예를 들어, 마이코플라스마 오염 물질의 제거는 효율적이지 않다7. 실험실 직원이 적절한 교육을 받고, 세포 배양실이 독립적이며, 표준 절차를 사용하는지 확인하기 위해 초기에 시간을 할애하면 시간과 비용을 절약할 수 있습니다.

Protocol

1. 준비 일반세포 배양실에서만 착용하고 실험실의 다른 부분에서는 착용하지 않도록 지정된 깨끗한 실험실 코트를 착용하십시오.참고: 실험복은 멸균 상태일 필요가 없습니다. 다른 표면에 닿지 않은 새 장갑을 착용하십시오. 장갑이 단단히 끼워졌는지 확인하십시오. 니트릴, 파우더가 없는 장갑이 가장 좋습니다.알림: 장갑은 멸균 상태일 필요가 없습니…

Representative Results

이 백서에 설명된 적절한 세포 배양 기술과 관행을 따르지 않으면 연구 세포 배양 실험실에서 곰팡이 및 박테리아에 의한 오염이 발생할 수 있습니다. 그림 2 는 현탁액과 부착 배양 모두에서 오염을 포함하는 플라스크를 보여줍니다. 무균 기술을 따르지 않으면 2-3일 후에 곰팡이 오염이 발생할 수 있습니다. 매체에 떠 있는 둥근 퍼지 볼은 현탁 세포에?…

Discussion

오염은 세포 배양 작업을 수행할 때 주요 관심사 중 하나이지만, 이 원고에 요약된 관행과 기술은 위험을 완화하는 데 도움이 될 것입니다. 중요한 단계에는 세포 배양실에서만 사용되는 깨끗한 실험실 코트 착용, 70% EtOH가 자주 분사되고 세포주 간 전환 시 교체되는 깨끗한 분말 없는 장갑 사용, 각 개인이 배지 병을 공유하지 않도록 권장, 작업 완료 전후에 캐비닛을 철저히 청소하는 것이 포함됩…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 Howard Hughes Medical Institute(HHMI)의 자금 지원 덕분에 가능했습니다. 원고를 읽고 지속적인 지원을 해주신 연구실장인 Jue Chen, 도움이 되는 편집과 의견을 주신 Donna Tallent, 이 원고의 비디오 구성 요소에 도움을 주신 Rockefeller University 정보 기술과의 Jeff Hennefeld에게 감사드립니다.

Materials

DPBS Gibco 14-190-144
DMEM F-12 Media ATCC 30-2006
Glass Baffled Flask Pyrex  09-552-40
Glass Pipettes Fisher  13-678-6B
Pipette Aid Drummond 13-681-15A 
Serological Pipette Corning 07-200-573
T75 flask Corning 07-202-004
Trypsin Gibco 25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques

Referências

  1. Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
  2. Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
  3. Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
  4. Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
  5. Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
  6. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
  7. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  8. Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
  9. Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
  10. Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
  11. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020)
  12. Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
  13. Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
  14. Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
  15. Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  16. Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference (2023)
  17. United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004)
  18. Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023)
  19. Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
  20. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
  21. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).
  22. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020)
  23. Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
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Citar este artigo
Tanasescu, A. Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory. J. Vis. Exp. (197), e64769, doi:10.3791/64769 (2023).

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