Cellekulturteknikker og praksis for å unngå forurensning av sopp og bakterier i forskningscellekulturlaboratoriet

Summary

Denne protokollen presenterer viktige cellekulturteknikker og praksis som skal brukes i forskningscellekulturlaboratoriet for å unngå forurensning av sopp og bakterier. Innenfor kategorien bakterier vil det bli lagt spesiell vekt på å forhindre mykoplasmaforurensning.

Abstract

Cellekultur er en delikat ferdighet som er nødvendig for å dyrke menneske-, dyre- og insektceller, eller annet vev, i et kontrollert miljø. Målet med protokollen er å understreke de riktige teknikkene som brukes i et forskningslaboratorium for å forhindre forurensning fra sopp og bakterier. Spesiell vekt legges på å unngå mykoplasmaforurensning, en stor bekymring i cellekulturrommet på grunn av sin lille størrelse og resistens mot de fleste antibiotika som brukes til cellekultur. De samme teknikkene sikrer kontinuerlig vekst og opprettholder sunne celler. For både nye og erfarne cellekulturbrukere er det viktig å konsekvent følge disse beste praksisene for å redusere risikoen for forurensning. En gang i året bør laboratorier gjennomgå beste praksis for cellekultur og følge opp med en diskusjon eller tilleggsopplæring om nødvendig. Å iverksette tidlige tiltak for å forhindre forurensning i utgangspunktet vil spare tid og penger, sammenlignet med å rydde opp etter at forurensning oppstår. Universell beste praksis holder cellekulturer sunne, og reduserer dermed behovet for å stadig tine nye celler, kjøpe dyre cellekulturmedier og redusere mengden inkubatordekontaminering og nedetid.

Introduction

Cellekultur har mange bruksområder i forskningslaboratoriet. Siden opprinnelsen til cellekultur i begynnelsen av det 20. århundre har cellelinjer bidratt til å fremme vitenskapen. Cellelinjer har flere fordeler; Ulike cellelinjer kan hjelpe forskere med å studere cellebiologi, produsere baculovirus for videre studier, eller produsere store mengder av et protein av interesse, for å nevne noen¹. Noen andre bruksområder inkluderer å studere vevsvekst, bidra til å fremme vaksineutvikling, toksikologisk forskning, studere rollen som gener i friske organismer og syke modeller, og produksjon av hybridcellelinjer ^2,3. Cellelinjer kan også muliggjøre legemiddelproduksjon³. Riktig aseptisk teknikk er nødvendig når du arbeider med cellelinjer; Praksisene og teknikkene som er skissert i dette manuskriptet gjelder for forskningslaboratorier der cellekulturarbeid utføres. Andre laboratorieinnstillinger diskuteres ikke.

Forurensning er ofte den primære bekymringen når du utfører cellekulturarbeid. I sammenheng med dette papiret refererer forurensning generelt til sopp og bakterier. Det overordnede målet med metoden som er skissert i denne artikkelen, er å beskrive de beste fremgangsmåtene for å unngå kontaminering grundig. Alle laboratoriemedlemmer bør følge disse praksisene når de arbeider i et forskningslaboratoriums cellekulturrom. Laboratorier bør sikre at alle arbeidstakere er aktive deltakere i å bruke disse beste praksisene for å forhindre forurensning. Kunnskapen om riktig praksis og teknikker vil bidra til å sikre at cellekulturer forblir levedyktige, sunne og fri for forurensning. Utviklingen av denne teknikken er basert på litteraturforskning, syv års erfaring med å jobbe med cellekulturer, og behovet for en metode som både nybegynnere og erfarne cellekulturarbeidere kan referere til årlig.

Det er behov for en klar, standardisert teknikk som alle forskningscellekulturlaboratorier bør følge. Mye av litteraturen om cellekulturforurensning diskuterer påvisning av mykoplasma, aseptiske teknikker, forurensningskilder, eliminering av forurensninger og forebygging ved bruk av antibiotika og regelmessig testing 4,5,6,7,8. Selv om denne informasjonen er nyttig, er det ingen videoer til stede i litteraturen som demonstrerer de riktige cellekulturteknikkene man bør følge. Fordelen med praksisen som presenteres over alternative teknikker er et fokus på å forhindre forurensning før det skjer, i stedet for å oppdage og korrigere feil senere. Videre er en grundig demonstrasjon av aseptiske teknikker, en diskusjon om forebygging av sopp og bakterievekst, og informasjon om luftstrøm i biosikkerhetskabinettet verdifullt for både nybegynnere og erfarne cellekulturarbeidere.

Bakterier og sopp er de to vanligste typene miljøgifter. Innenfor bakteriekategorien er mykoplasma en stor bekymring på grunn av sin lille størrelse og evne til å spre seg mens den forblir ubemerket. De er selvreplikerende organismer uten stiv cellevegg som er avhengige av eukaryote celler for å vokse. De har reduserte metabolske evner og kan formere seg sterkt mens de forblir ukjente i rutinemessig visuell inspeksjon av cellekulturer og regelmessig mikroskopisk analyse, selv om transmisjonselektronmikroskopi kan oppdage mykoplasma ^9,10. Videre kan de passere gjennom mikrobiologiske filtre¹⁰. Cellekulturmedium gir mykoplasma næringsstoffer, men dessverre påvirker ikke supplering av medier med antibiotika mykoplasma¹⁰. Man bør merke seg at det generelt ikke er nødvendig å supplere media med antibiotika; Riktige teknikker bør være tilstrekkelig for å holde forurensning i sjakk. Infeksjon med mykoplasma fører ikke til umiddelbar celledød, men det er bekymringsfullt for forskere da det påvirker datareproduserbarhet og kvalitet.

Alt laboratoriepersonell bør strengt overholde god cellekulturpraksis. Kulturer bør testes for mykoplasma etter at de er nylig kjøpt, mens de for tiden dyrkes, før kryopreservering, og når de tines fra flytende nitrogen ^2,10. Ulike tester er tilgjengelige på markedet ved bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR), enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) eller immunfarging. ³ Litteraturen indikerer at “humane isolater representerer en stor prosentandel av mykoplasmaforurensningene som finnes i cellekultur”⁵. Selv om mer enn 200 mykoplasmaarter er beskrevet, står omtrent seks av disse for de fleste infeksjoner. Disse seks artene er M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale og Acholeplasma laidlawii 10. Som med andre typer forurensning, bringer luft og aerosoler disse inn i cellekulturer⁵. Dette gjentas i andre artikler siden “den menneskelige operatøren er potensielt den største faren i laboratoriet”⁷. Selv om dette gjøres gjennom menneskelig feil, kan risikoen elimineres hvis en standard prosedyre følges. Utskilling fra personell er ikke begrenset til bare mykoplasmaforurensning; Cellekulturer i ett laboratorium er vanligvis infisert med de samme mykoplasmaartene, noe som indikerer at forurensning sprer seg fra en kolbe til en annen på grunn av feil cellekulturteknikker¹⁰.

Forebygging av krysskontaminering er også en annen grunn til at riktige cellekulturteknikker bør følges. Det bemerkes at minst 15%-18% av cellelinjer over hele verden kan være krysskontaminert eller feilidentifisert^11,12. I tillegg til å teste cellelinjer for mykoplasmaforurensning, bør de også testes for krysskontaminering¹⁰. For menneskelige cellelinjer er cellelinjeautentisering ved en billig DNA-basert teknikk kalt STR-profilering (Short Tandem Repeat) den gjeldende internasjonale referansestandarden, da det er en enkel måte å bekrefte cellelinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identifisere feilmerkede eller krysskontaminerte cellelinjer, men det kan ikke oppdage feil vevopprinnelse^10,13,14. Gyldigheten av forskningsdata kan bli kompromittert hvis cellelinjer er feilmerket, feilaktig identifisert eller forurenset¹³. I likhet med andre typer forurensning kan krysskontaminering oppstå på grunn av dårlig teknikk som forårsaker at aerosoler sprer seg, feilaktig kontakt som fører til feil celletype som kommer inn i en kolbe, eller bruker samme medieflaske og reagenser med forskjellige cellelinjer¹⁰. Ingen deling av medieflasker skal forekomme; Deling av en flaske media mellom to forskjellige cellelinjer kan tillate at disse cellepopulasjonene blandes, noe som fører til at den raskere voksende celletypen helt tar over kolben. Denne erstatningen er ikke merkbar og fører til feilmerking og feilidentifikasjon². En cellelinje kan også forveksles med en annen hvis kulturer forveksles under håndtering eller merking¹⁰. Nøye oppmerksomhet bør rettes mot å holde reagenser, media og kolber skilt fra hverandre. Hvert laboratoriemedlem skal ha sine egne medieflasker; Ingen deling skal skje mellom laboratoriemedlemmer. Cellelinjer selv bør kjøpes fra en kvalifisert cellebank og leverandør. Laboratorier bør ikke dele celler. Studier viser at selv om STR- og mykoplasmatester brukes regelmessig, har mange forskningsartikler i litteraturen allerede brukt feilidentifiserte eller forurensede cellelinjer¹⁵. Å sile gjennom forskningen for å finne disse problematiske artiklene og informere leserne om denne saken med tilbakevirkende kraft er tungvint. Forebygging er den beste måten å sikre at dette problemet ikke oppstår i utgangspunktet.

Den enkle virkningen av å sprøyte gjenstander med 70% EtOH kan drepe organismer; 70% EtOH virker ved å denaturere proteiner og oppløse lipider i de mest forurensende organismer, inkludert bakterier og sopp¹⁶. Studier har vist at 70% er den mest effektive konsentrasjonen; overflateproteiner koagulerer ikke raskt med 70% EtOH slik at de kan komme inn i cellen, mens vannet det inneholder er nødvendig for denatureringsprosessen av proteiner. På grunn av konsentrasjonsforskjellen mellom vann og alkohol på hver side av celleveggen, kommer 70% EtOH inn i cellen for å denaturere både enzymatiske og strukturelle proteiner. Hvis muggvekst observeres i kolber, må hele inkubatoren dekontamineres ved først å sprøyte den med 70% EtOH og tørke den tørr, etterfulgt av en 16 timers inkubasjon over natten ved 60 ° C¹⁷. Dette dreper de fleste mugg og eventuelle bakterier.

Den største fordelen med forebyggende praksis over alternative teknikker for å eliminere forurensning etter at den oppstår, er at ved å forhindre forurensning tidlig, kan laboratoriearbeidere være sikre på at deres cellekulturer er sunne, og det vil ikke være høye kostnader forbundet med dekontaminering av inkubatorer eller kassering av cellekulturer. Eliminering av mykoplasmaforurensninger etter for eksempel er ikke effektiv⁷. Å ta seg tid tidlig for å sikre at laboratoriepersonell er riktig opplært, cellekulturrommet er selvstendig, og en standardprosedyre brukes, vil spare tid og penger.

Protocol

1. Forberedelser GenereltBruk en ren laboratoriefrakk som bare skal brukes i cellekulturrommet og ingen andre deler av laboratoriet.MERK: Laboratoriefrakken trenger ikke å være steril. Bruk nye hansker som ikke har rørt noen andre overflater. Pass på at hanskene sitter tett. Nitril, pulverfrie hansker er best.MERK: Hanskene trenger ikke å være sterile. For å forberede deg på arbeid, spray hanskene, laboratoriefrakkhylsene og interiøret i det biolo…

Representative Results

Hvis de riktige cellekulturteknikkene og praksisene som er skissert i denne artikkelen, ikke følges, kan forurensning av sopp og bakterier forekomme i forskningscellekulturlaboratoriet. Figur 2 viser kolber som inneholder forurensning i både suspensjon og adherent kultur. Når du ikke følger aseptiske teknikker, kan muggforurensning oppstå 2-3 dager senere. Runde fuzzy baller som flyter i media er merkbare i suspensjonsceller, mens muggvekst i festede celler k…

Discussion

Mens forurensning er en av de viktigste bekymringene når du utfører cellekulturarbeid, vil praksis og teknikker som er skissert i dette manuskriptet bidra til å redusere risikoen. De kritiske trinnene inkluderer bruk av et rent laboratoriebelegg, som bare brukes i cellekulturrommet, ved bruk av rene, pulverfrie hansker som sprayes med 70% EtOH ofte og som endres når du bytter mellom cellelinjer, oppfordrer hver enkelt til ikke å dele medieflasker, rengjør skapet grundig før og etter endt arbeid, Pent utpakking av…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques