Методы и методы культивирования клеток для предотвращения загрязнения грибами и бактериями в исследовательской лаборатории клеточных культур

Summary

В этом протоколе представлены основные методы и методы культивирования клеток, которые будут использоваться в исследовательской лаборатории клеточных культур, чтобы избежать заражения грибками и бактериями. В категории бактерий особый акцент будет сделан на предотвращении заражения микоплазмами.

Abstract

Клеточная культура — это тонкий навык, необходимый для выращивания клеток человека, животных и насекомых или других тканей в контролируемой среде. Цель протокола состоит в том, чтобы подчеркнуть правильные методы, используемые в исследовательской лаборатории для предотвращения загрязнения грибками и бактериями. Особое внимание уделяется предотвращению заражения микоплазмой, что является серьезной проблемой в помещении для культивирования клеток из-за его небольшого размера и устойчивости к большинству антибиотиков, используемых для культивирования клеток. Эти же методы обеспечивают непрерывный рост и поддерживают здоровые клетки. Как для новых, так и для опытных пользователей клеточных культур важно последовательно придерживаться этих передовых методов, чтобы снизить риск заражения. Раз в год лаборатории должны проводить обзор передового опыта в области клеточных культур и при необходимости проводить обсуждение или дополнительное обучение. Заблаговременное принятие мер по предотвращению загрязнения в первую очередь сэкономит время и деньги по сравнению с очисткой после загрязнения. Универсальные передовые методы поддерживают здоровье клеточных культур, тем самым уменьшая необходимость постоянного размораживания новых клеток, покупки дорогостоящих сред для клеточных культур и сокращения количества обеззараживания инкубаторов и времени простоя.

Introduction

Клеточная культура имеет множество применений в исследовательской лаборатории. С момента возникновения клеточных культур в начале 20-го века клеточные линии помогли продвинуть науку. Клеточные линии имеют ряд преимуществ; Различные клеточные линии могут помочь исследователям изучать клеточную биологию, производить бакуловирус для дальнейших исследований или производить большое количество белка, представляющего интерес, и это лишь некоторые из^них. Некоторые дополнительные виды использования включают изучение роста тканей, помощь в разработке вакцин, токсикологические исследования, изучение роли генов в здоровых организмах и больных моделях, а также производство гибридных клеточных линий ^2,3. Клеточные линии также могут обеспечивать производство лекарств³. При работе с клеточными линиями необходимы правильные асептические методики; Методы и методы, изложенные в этой рукописи, применимы к исследовательским лабораториям, где проводятся работы с клеточными культурами. Другие лабораторные условия не обсуждаются.

Загрязнение часто является основной проблемой при выполнении работы с клеточными культурами. В контексте этой статьи под загрязнением обычно понимаются грибки и бактерии. Общая цель метода, изложенного в этой статье, состоит в том, чтобы подробно описать лучшие практики предотвращения загрязнения. Все члены лаборатории должны придерживаться этих правил при работе в комнате клеточных культур исследовательской лаборатории. Лаборатории должны обеспечить, чтобы все работники были активными участниками использования этих передовых методов для предотвращения загрязнения. Знание правильных практик и методов поможет гарантировать, что клеточные культуры останутся жизнеспособными, здоровыми и свободными от загрязнения. Разработка этого метода основана на изучении литературы, семилетнем опыте работы с клеточными культурами и необходимости метода, к которому могут обращаться как новички, так и опытные работники клеточных культур на ежегодной основе.

Существует потребность в четкой, стандартизированной методике, которой должны следовать все исследовательские лаборатории клеточных культур. Большая часть литературы по загрязнению клеточных культур обсуждает обнаружение микоплазмы, асептические методы, источники загрязнения, устранение загрязняющих веществ и профилактику с помощью антибиотиков и регулярного тестирования 4,5,6,7,8. Хотя эта информация полезна, в литературе нет видеороликов, демонстрирующих правильные методы культивирования клеток, которым следует следовать. Преимущество представленных методов перед альтернативными методами заключается в том, что основное внимание уделяется предотвращению загрязнения до того, как оно произойдет, а не обнаружению и исправлению ошибок позже. Кроме того, тщательная демонстрация асептических методов, обсуждение предотвращения роста грибков и бактерий, а также информация о воздушном потоке шкафа биобезопасности ценны как для начинающих, так и для опытных работников клеточных культур.

Бактерии и грибки являются двумя наиболее распространенными типами загрязняющих веществ. В категории бактерий микоплазма является серьезной проблемой из-за ее небольшого размера и способности размножаться, оставаясь незамеченной. Это самовоспроизводящиеся организмы без жесткой клеточной стенки, рост которых зависит от эукариотических клеток. Они имеют сниженные метаболические возможности и могут сильно размножаться, оставаясь нераспознанными при обычном визуальном осмотре клеточных культур и регулярном микроскопическом анализе, хотя просвечивающая электронная микроскопия может обнаружить микоплазму ^9,10. Более того, они могут проходить через микробиологические фильтры¹⁰. Питательная среда для клеточных культур обеспечивает микоплазму питательными веществами, хотя, к сожалению, добавление антибиотиков не влияет на микоплазму¹⁰. Следует отметить, что, как правило, нет необходимости дополнять среды антибиотиками; Надлежащих методов должно быть достаточно для предотвращения загрязнения. Заражение микоплазмой не приводит к немедленной гибели клеток, но это беспокоит исследователей, поскольку влияет на воспроизводимость и качество данных.

Весь персонал лаборатории должен строго придерживаться надлежащей практики культивирования клеток. Культуры следует проверять на микоплазму после того, как они были недавно приобретены, пока они в настоящее время выращиваются, перед криоконсервацией и при размораживании от жидкого азота ^2,10. На рынке доступны различные тесты, использующие полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) или иммуноокрашивание. ³ В литературе указывается, что «человеческие изоляты представляют собой большой процент загрязнителей микоплазмы, обнаруженных в культуре клеток»⁵. Хотя было описано более 200 видов микоплазмы, около шести из них являются причиной большинства инфекций. Этими шестью видами являются M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale и Acholeplasma laidlawii¹⁰. Как и в случае с другими типами загрязнения, воздух и аэрозоли переносят их в клеточные культуры⁵. Это повторяется в других работах, поскольку «человек-оператор потенциально представляет наибольшую опасность в лаборатории»⁷. Хотя это делается из-за человеческой ошибки, риск можно устранить, если следовать стандартной процедуре. Выделение от персонала не ограничивается только заражением микоплазмой; Клеточные культуры в одной лаборатории обычно инфицированы одними и теми же видами микоплазмы, что указывает на то, что загрязнение распространяется от одной колбы к другой из-за неправильных методов культивирования клеток¹⁰.

Предотвращение перекрестного загрязнения также является еще одной причиной, по которой следует следовать правильным методам культивирования клеток. Отмечается, что, по крайней мере, 15–18% клеточных линий во всем мире могут быть перекрестно загрязнены или неправильно идентифицированы^11,12. В дополнение к тестированию клеточных линий на микоплазменное загрязнение, они также должны быть проверены на перекрестную контаминацию¹⁰. Для клеточных линий человека аутентификация клеточных линий с помощью недорогого метода на основе ДНК, называемого профилированием короткого тандемного повтора (STR), является текущим международным эталонным стандартом, поскольку это простой способ подтвердить идентичность клеточной линии 2,10,13,14. STR может идентифицировать неправильно маркированные или перекрестно загрязненные клеточные линии, но он не может обнаружить неправильное происхождение ткани^10,13,14. Достоверность данных исследований может быть поставлена под угрозу, если клеточные линии неправильно маркированы, неправильно идентифицированы или загрязнены¹³. Подобно другим типам загрязнения, перекрестное загрязнение может происходить из-за плохой техники, вызывающей распространение аэрозолей, ошибочного контакта, приводящего к попаданию неправильного типа клеток в колбу, или использования одной и той же бутылки с носителем и реагентов с разными клеточными линиями¹⁰. Совместное использование бутылок с носителями не должно происходить; Совместное использование одной бутылки среды между двумя разными клеточными линиями может позволить этим клеточным популяциям смешиваться, что приводит к тому, что более быстрорастущий тип клеток полностью захватывает колбу. Эта замена не заметна и приводит к неправильной маркировке и неправильной идентификации². Клеточная линия также может быть ошибочно принята за другую, если культуры перепутаны во время обработки или маркировки¹⁰. Особое внимание следует уделять хранению реагентов, сред и колб отдельно друг от друга. У каждого члена лаборатории должны быть свои собственные бутылки-носители; Между членами лаборатории не должно происходить совместное использование. Сами клеточные линии должны быть приобретены у квалифицированного банка клеток и поставщика. Лаборатории не должны делиться клетками. Исследования показывают, что, хотя тесты STR и микоплазмы используются регулярно, во многих исследовательских работах в литературе уже использовались неправильно идентифицированные или загрязненные клеточные линии¹⁵. Просеивание исследований, чтобы найти эти проблемные статьи и задним числом проинформировать читателей об этом вопросе, является громоздким. Профилактика – лучший способ гарантировать, что эта проблема не возникнет в первую очередь.

Простое действие распыления предметов с 70% EtOH может убить организмы; 70% EtOH работает путем денатурации белков и растворения липидов в наиболее часто загрязняющих организмах, включая бактерии и грибы¹⁶. Исследования показали, что 70% является наиболее эффективной концентрацией; поверхностные белки не коагулируют быстро с 70% EtOH, поэтому они могут проникнуть в клетку, в то время как содержащаяся в них вода необходима для процесса денатурации белков. Из-за разницы в концентрациях воды и спирта по обе стороны клеточной стенки 70% EtOH поступает в клетку для денатурации как ферментативных, так и структурных белков. Если в колбах наблюдается рост плесени, весь инкубатор необходимо обеззаразить, сначала опрыскав его 70% EtOH и вытерев насухо, а затем 16-часовую ночную инкубацию при 60 ° C¹⁷. Это убивает большую часть плесени и любых бактерий.

Основное преимущество профилактических практик по сравнению с альтернативными методами устранения загрязнения после его возникновения заключается в том, что, предотвращая загрязнение на ранней стадии, лабораторные работники могут быть уверены, что их клеточные культуры здоровы и не будет высоких затрат, связанных с обеззараживанием инкубаторов или выбрасыванием клеточных культур. Удаление микоплазменных загрязнителей, например, после, не является эффективным⁷. Если вы потратите время на то, чтобы убедиться, что лабораторный персонал должным образом обучен, комната для культивирования клеток автономна, а стандартная процедура используется, это сэкономит время и деньги.

Protocol

1. Подготовка ОбщееНосите чистый лабораторный халат, предназначенный для ношения только в комнате клеточных культур и ни в каких других частях лаборатории.ПРИМЕЧАНИЕ: Лабораторный халат не обязательно должен быть стерильным. Наденьте новые перчатки, которы?…

Representative Results

Если не следовать надлежащим методам и практикам культивирования клеток, изложенным в этой статье, в исследовательской лаборатории клеточных культур может произойти заражение грибами и бактериями. На рисунке 2 показаны колбы, содержащие загрязнение как в суспензии, та…

Discussion

В то время как загрязнение является одной из основных проблем при выполнении работы с клеточными культурами, методы и методы, изложенные в этой рукописи, помогут снизить риски. Критические шаги включают в себя ношение чистого лабораторного халата, который используется только в комнате…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques