Técnicas y prácticas de cultivo celular para evitar la contaminación por hongos y bacterias en el laboratorio de investigación de cultivos celulares
Summary
Este protocolo presenta técnicas y prácticas esenciales de cultivo celular para ser utilizadas en el laboratorio de investigación de cultivos celulares para evitar la contaminación por hongos y bacterias. Dentro de la categoría de bacterias, se hará especial hincapié en la prevención de la contaminación por micoplasma.
Abstract
El cultivo celular es una habilidad delicada necesaria para cultivar células humanas, animales e insectos, u otros tejidos, en un ambiente controlado. El objetivo del protocolo es enfatizar las técnicas correctas utilizadas en un laboratorio de investigación para prevenir la contaminación por hongos y bacterias. Se hace especial hincapié en evitar la contaminación por micoplasma, una preocupación importante en la sala de cultivo celular debido a su pequeño tamaño y resistencia a la mayoría de los antibióticos utilizados para el cultivo celular. Estas mismas técnicas aseguran el crecimiento continuo y mantienen las células sanas. Tanto para los usuarios nuevos como para los experimentados de cultivos celulares, es importante adherirse constantemente a estas mejores prácticas para mitigar el riesgo de contaminación. Una vez al año, los laboratorios deben revisar las mejores prácticas de cultivo celular y hacer un seguimiento con una discusión o capacitación adicional si es necesario. Tomar medidas tempranas para prevenir la contaminación en primer lugar ahorrará tiempo y dinero, en comparación con la limpieza después de que ocurra la contaminación. Las mejores prácticas universales mantienen los cultivos celulares saludables, reduciendo así la necesidad de descongelar constantemente nuevas células, comprar costosos medios de cultivo celular y reducir la cantidad de descontaminación de la incubadora y el tiempo de inactividad.
Introduction
El cultivo celular tiene muchos usos en el laboratorio de investigación. Desde los orígenes del cultivo celular a principios del siglo 20, las líneas celulares han ayudado a avanzar en la ciencia. Las líneas celulares tienen varias ventajas; Varias líneas celulares pueden ayudar a los investigadores a estudiar la biología celular, producir baculovirus para estudios posteriores o producir grandes cantidades de una proteína de interés, por nombrar algunas1. Algunos usos adicionales incluyen el estudio del crecimiento de tejidos, ayudar a avanzar en el desarrollo de vacunas, la investigación toxicológica, el estudio del papel de los genes en organismos sanos y modelos enfermos, y la producción de líneas celulares híbridas 2,3. Las líneas celulares también pueden permitir la producción de fármacos3. Las técnicas asépticas adecuadas son necesarias cuando se trabaja con líneas celulares; Las prácticas y técnicas descritas en este manuscrito son aplicables a los laboratorios de investigación donde se realiza el trabajo de cultivo celular. No se discuten otros entornos de laboratorio.
La contaminación es a menudo la principal preocupación cuando se realiza el trabajo de cultivo celular. En el contexto de este documento, la contaminación generalmente se refiere a hongos y bacterias. El objetivo general del método descrito en este documento es describir a fondo las mejores prácticas para evitar la contaminación. Todos los miembros del laboratorio deben adherirse a estas prácticas cuando trabajen en la sala de cultivo celular de un laboratorio de investigación. Los laboratorios deben asegurarse de que todos los trabajadores participen activamente en el uso de estas mejores prácticas para prevenir la contaminación. El conocimiento de las prácticas y técnicas correctas ayudará a garantizar que los cultivos celulares permanezcan viables, sanos y libres de contaminación. El desarrollo de esta técnica se basa en la investigación de la literatura, siete años de experiencia trabajando con cultivos celulares y la necesidad de un método al que tanto los principiantes como los trabajadores experimentados de cultivos celulares puedan consultar anualmente.
Existe la necesidad de una técnica clara y estandarizada que todos los laboratorios de cultivo celular de investigación deben seguir. Gran parte de la literatura sobre contaminación por cultivos celulares discute la detección de micoplasma, técnicas asépticas, fuentes de contaminación, eliminación de contaminantes y prevención mediante el uso de antibióticos y pruebas regulares 4,5,6,7,8. Si bien esta información es útil, no hay videos presentes en la literatura que demuestren las técnicas adecuadas de cultivo celular que uno debe seguir. La ventaja de las prácticas presentadas sobre las técnicas alternativas es un enfoque en prevenir la contaminación antes de que ocurra, en lugar de detectar y corregir errores más tarde. Además, una demostración exhaustiva de técnicas asépticas, una discusión sobre la prevención del crecimiento de hongos y bacterias, e información sobre el flujo de aire del gabinete de bioseguridad son valiosos tanto para los trabajadores de cultivos celulares novatos como para los experimentados.
Las bacterias y los hongos son los dos tipos más comunes de contaminantes. Dentro de la categoría de bacterias, el micoplasma es una preocupación importante debido a su pequeño tamaño y capacidad para proliferar sin ser notado. Son organismos autorreplicantes sin pared celular rígida que dependen de las células eucariotas para crecer. Tienen capacidades metabólicas reducidas y pueden multiplicarse en gran medida mientras permanecen sin ser reconocidos en la inspección visual rutinaria de cultivos celulares y análisis microscópicos regulares, aunque la microscopía electrónica de transmisión puede detectar micoplasma 9,10. Además, pueden pasar a través de filtros microbiológicos10. El medio de cultivo celular proporciona nutrientes al micoplasma, aunque desafortunadamente la suplementación de los medios con antibióticos no afecta al micoplasma10. Se debe tener en cuenta que, en general, no es necesario complementar los medios con antibióticos; Las técnicas adecuadas deberían ser suficientes para mantener a raya la contaminación. La infección con micoplasma no conduce a la muerte celular inmediata, pero es preocupante para los investigadores, ya que afecta la reproducibilidad y la calidad de los datos.
Todo el personal de laboratorio debe adherirse estrictamente a las buenas prácticas de cultivo celular. Los cultivos deben analizarse para detectar micoplasma después de que se hayan comprado recientemente, mientras se cultivan actualmente, antes de la criopreservación y cuando se descongelan del nitrógeno líquido 2,10. Hay diferentes pruebas disponibles en el mercado utilizando reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o inmunotinción. 3 La literatura indica que “los aislados humanos representan un gran porcentaje de los contaminantes de micoplasma encontrados en el cultivo celular”5. Aunque se han descrito más de 200 especies de micoplasmas, alrededor de seis de ellas representan la mayoría de las infecciones. Estas seis especies son M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale y Acholeplasma laidlawii10. Al igual que con otros tipos de contaminación, el aire y los aerosoles los llevan a los cultivos celulares5. Esto se repite en otros documentos, ya que el “operador humano es potencialmente el mayor peligro en el laboratorio”7. Aunque esto se hace a través de un error humano, el riesgo puede eliminarse si se sigue un procedimiento estándar. El desprendimiento del personal no se limita solo a la contaminación por micoplasma; Los cultivos celulares en un laboratorio generalmente están infectados con la misma especie de micoplasma, lo que indica que la contaminación se propaga de un matraz a otro debido a técnicas inadecuadas de cultivo celular10.
La prevención de la contaminación cruzada es también otra razón por la que se deben seguir las técnicas adecuadas de cultivo celular. Se observa que al menos entre el 15% y el 18% de las líneas celulares en todo el mundo pueden estar contaminadas o identificadas erróneamente11,12. Además de analizar las líneas celulares para detectar contaminación por micoplasma, también deben analizarse para detectar contaminación cruzada10. Para las líneas celulares humanas, la autenticación de líneas celulares mediante una técnica económica basada en el ADN llamada perfil de repetición corta en tándem (STR) es el estándar de referencia internacional actual, ya que es una manera fácil de confirmar la identidad de la línea celular 2,10,13,14. STR puede identificar líneas celulares mal etiquetadas o contaminadas de forma cruzada, pero no puede detectar el origen incorrecto del tejido10,13,14. La validez de los datos de la investigación puede verse comprometida si las líneas celulares están mal etiquetadas, identificadas erróneamente o contaminadas13. Al igual que otros tipos de contaminación, la contaminación cruzada puede ocurrir debido a una técnica deficiente que hace que los aerosoles se propaguen, un contacto erróneo que conduce a que el tipo de célula incorrecto ingrese a un matraz, o el uso de la misma botella de medios y reactivos con diferentes líneas celulares10. No se debe compartir botellas de medios; Compartir una botella de medios entre dos líneas celulares diferentes puede permitir que esas poblaciones celulares se mezclen, lo que lleva al tipo de célula de crecimiento más rápido a hacerse cargo completamente del matraz. Este reemplazo no se nota y conduce a un etiquetado incorrecto y una identificación errónea2. Una línea celular también puede confundirse con otra si se confunden cultivos durante la manipulación o el etiquetado10. Se debe prestar especial atención a mantener los reactivos, medios y frascos separados entre sí. Cada miembro del laboratorio debe tener sus propias botellas de medios; No se debe compartir entre los miembros del laboratorio. Las líneas celulares deben comprarse a un banco de células y proveedor calificado. Los laboratorios no deben compartir células. Los estudios muestran que, aunque las pruebas de STR y micoplasma se utilizan regularmente, muchos trabajos de investigación en la literatura ya han utilizado líneas celulares mal identificadas o contaminadas15. Examinar la investigación para encontrar estos documentos problemáticos e informar retroactivamente a los lectores sobre este asunto es engorroso. La prevención es la mejor manera de garantizar que este problema no ocurra en primer lugar.
La simple acción de rociar artículos con 70% de EtOH puede matar organismos; 70% EtOH actúa desnaturalizando proteínas y disolviendo lípidos en los organismos más comúnmente contaminantes, incluyendo bacterias y hongos16. Los estudios han demostrado que el 70% es la concentración más efectiva; Las proteínas de superficie no coagulan rápidamente con un 70% de EtOH para que puedan entrar en la célula, mientras que el agua que contiene es necesaria para el proceso de desnaturalización de las proteínas. Debido a la diferencia de concentración de agua y alcohol a ambos lados de la pared celular, el 70% de EtOH ingresa a la célula para desnaturalizar las proteínas enzimáticas y estructurales. Si se observa crecimiento de moho en matrazs, toda la incubadora debe descontaminarse rociándola primero con EtOH al 70% y secándola, seguida de una incubación nocturna de 16 h a 60 °C17. Esto mata la mayoría del moho y cualquier bacteria.
La principal ventaja de las prácticas de prevención sobre las técnicas alternativas para eliminar la contaminación después de que ocurra es que al prevenir la contaminación desde el principio, los trabajadores de laboratorio pueden estar seguros de que sus cultivos celulares están sanos y no habrá altos costos asociados con la descontaminación de incubadoras o el descarte de cultivos celulares. La eliminación de contaminantes de micoplasma después, por ejemplo, no es eficiente7. Tomarse el tiempo desde el principio para garantizar que el personal del laboratorio esté debidamente capacitado, que la sala de cultivo celular sea autónoma y que se utilice un procedimiento estándar ahorrará tiempo y dinero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien la contaminación es una de las principales preocupaciones al realizar trabajos de cultivo celular, las prácticas y técnicas descritas en este manuscrito ayudarán a mitigar los riesgos. Los pasos críticos incluyen usar una bata de laboratorio limpia, que solo se usa en la sala de cultivo celular, usar guantes limpios y sin polvo que se rocían con 70% de EtOH a menudo y que se cambian al cambiar entre líneas celulares, alentar a cada individuo a no compartir botellas de medios, limpiar el gabinete a fondo an…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación del Instituto Médico Howard Hughes (HHMI). Queremos agradecer a nuestro jefe de laboratorio, Jue Chen, por leer el manuscrito y por su continuo apoyo, Donna Tallent por sus útiles ediciones y comentarios, y Jeff Hennefeld del Departamento de Tecnología de la Información de la Universidad Rockefeller por su ayuda con el componente de video de este manuscrito.
Materials
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
Referências
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