זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה
Summary
במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי אפופלסטי (ROS) ברקמות אורז בתגובה חיסונית מולקולרית המופעלת על ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן. שיטה זו פשוטה, סטנדרטית ומייצרת תוצאות הניתנות לשחזור בתנאים מבוקרים.
Abstract
מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקידים חיוניים במגוון תהליכים ביולוגיים, כולל חישה של עקה אביוטית וביוטית. עם זיהום פתוגן או אתגר עם כימיקלים הקשורים לפתוגן (דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים [PAMPs]), מערך של תגובות חיסוניות, כולל התפרצות ROS, מושרות במהירות בצמחים, אשר נקרא PAMP-triggered immunity (PTI). התפרצות ROS היא תגובת PTI בולטת, אשר מזרזת על ידי קבוצה של NADPH oxidases מקומי של קרום פלזמה – חלבונים ממשפחת RBOH. הרוב המכריע של ROS מורכב מי חמצן (H 2 O2), אשר ניתןלזהות בקלות ובהתמדה על ידי שיטת chemiluminescence מבוסס luminol. כימילומינסנציה היא תגובה המייצרת פוטונים שבה לומינול, או הנגזרת שלו (כגון L-012), עובר תגובת חמצון-חיזור עם ROS תחת פעולה של זרז. מאמר זה מתאר שיטה כימילומינסנציה אופטימלית מבוססת L-012 לזיהוי ייצור אפופלסט ROS בזמן אמת עם אליציטוט PAMP ברקמות אורז. השיטה קלה, יציבה, סטנדרטית וניתנת לשחזור בתנאים מבוקרים היטב.
Introduction
מיני חמצן תגובתי (ROS) כוללים סדרה של נגזרות חמצן פעילות מבחינה כימית, כולל רדיקלים של אניון סופראוקסיד (O2-) ונגזרותיו, רדיקלים הידרוקסילים (OH–), מי חמצן, ותוצרים של חמצן סינגלט או תגובות חיזור חמצון, המיוצרים באופן קבוע בפלסטידים ובכלורופלסטים, מיטוכונדריה, פרוקסיזומים ומקומות תת-תאיים אחרים1 . ROS ממלא תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים והם חיוניים לכל הצמחים 2,3,4. הספקטרום הרחב של תפקודי ROS משתנה מוויסות גדילה והתפתחות ועד לתפיסה של עקה אביוטית וביוטית 5,6,7,8.
במערכת החיסון של הצמח, קולטנים מקומיים של קרום הפלזמה של תאי הצמח – מה שמכונה קולטני זיהוי תבניות (PRR) – תופסים כימיקלים שמקורם בפתוגן – תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs). זיהוי זה מעורר סדרה של תגובות חיסוניות מהירות, כולל זרם סידן, התפרצות ROS ומפל MAPK; לכן, שכבת חסינות זו נקראת PAMP-triggered immunity (PTI). התפרצות ROS היא תגובת PTI בולטת, שקביעתה מיושמת באופן נרחב במחקרים הקשורים ל- PTI 9,10. ייצור ROS המופעל על ידי PAMPs מיוחס לחלבונים ממשפחת NADPH oxidase (הומולוג של קרום הפלזמה), או RBOH (Respiratory burst oxidase homolog), אשר מעבירים אלקטרונים מ-NADPH ציטוסולי או NADH לחמצן חוץ-תאי כדי לייצר סופראוקסיד (O 2–) אשר מומר באופן ספונטני למי חמצן (H 2 O 2) על ידי סופראוקסיד דיסמוטאז8 . פרץ ROS המופעל על ידי PAMP הוא מהיר למדי, מופיע רק כמה דקות לאחר טיפול PAMP ומגיע לשיא של ~ 10-12 דקות. הרוב המכריע של מולקולות ROS מכילות מי חמצן (H 2 O2), אשר ניתן לזהות בקלות ובהתמדה באמצעות בדיקת כימילומינסנציה.
בכימילומינסנציה, מגיב הכימילומינסנציה מגיב עם חמצן פעיל, תחת פעולה של זרז, כדי לייצר את מתווכי המצב הנרגש. לאחר מכן, האלקטרונים במכפלה חוזרים למצב הקרקע באמצעות מעבר לא קרינתי ופולטים פוטונים. ריאגנטים כימילומינסנטיים נפוצים כוללים luminol ו- L-012, כאשר luminol שולט ביישום11,12,13. עם זאת, חוקרים נוספים בוחרים ב- L-012 כדי לזהות ייצור ROS, מכיוון של- L-012 יש יעילות פליטת אור גבוהה בהרבה בתנאי pH ניטרליים או כמעט ניטרליים בהשוואה ללומינול.
מאמר זה מתאר שיטת כימילומינסנציה אופטימלית, המבוססת על L-012, לזיהוי בזמן אמת של ייצור ROS לאחר חיסול PAMPs בדיסקים ובמעטפת של רקמות-עלי אורז (Oryza sativa). השיטה המסופקת כאן היא פשוטה, יציבה וסטנדרטית, והיא ניתנת להתאמה גבוהה כדי לענות על צרכים ניסיוניים שונים. הנתונים המתקבלים בשיטה זו ניתנים לשחזור גבוה בתנאים מבוקרים היטב.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת מחקר זה הייתה לבסס שיטה יעילה ביותר לכימות ייצור מוקדם של ROS בתגובה ל-PAMP ברקמות אורז. שיטה זו מספקת הליך סטנדרטי לקביעה בזמן אמת של אפופלסט ROS המיוצר מרקמות אורז מטופלות. שיטה זו פשוטה בתפעול, נמוכה בעלות, ברורה בהרכב, ובלתי תלויה בערכות מסחריות. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לחקור את ה?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן שנחאי למדעי הטבע (מספר מענק: 21ZR1429300/BS1500016), אוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג (תוכנית Agri-X, מספר מענק: AF1500088/002), מרכז החדשנות השיתופית של שנחאי של זרעים חקלאיים (מספר מענק: ZXWH2150201/001) לג’יאנגבו פאן, ועל ידי פרויקט שיתוף הפעולה הרפואי-הנדסי של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (מספר מענק: 21X010301734) לקאן לי.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referências
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
