Chemiluminescence Assay를 통한 벼의 면역 반응에서 활성 산소 종 생산의 실시간 검출
Summary
여기에서 우리는 병원체 관련 분자 패턴 유발 면역 반응에서 벼 조직에서 아포플라스틱 활성 산소 종(ROS) 생성을 실시간으로 검출하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 간단하고 표준화되어 있으며 통제된 조건에서 재현성이 높은 결과를 생성합니다.
Abstract
활성 산소 종(ROS)은 비생물적 및 생물학적 스트레스 감지를 포함한 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 병원체 감염 또는 병원체 관련 화학 물질(병원체 관련 분자 패턴[PAMP])에 대한 도전 시, ROS 버스트를 포함한 일련의 면역 반응이 식물에서 빠르게 유도되며, 이를 PAMP 유발 면역(PTI)이라고 합니다. ROS 버스트는 특징적인 PTI 반응으로, 원형질막에 국한된 NADPH 산화효소(RBOH 계열 단백질) 그룹에 의해 촉매됩니다. 대부분의 ROS는 과산화수소(H2O2)를 포함하며, 이는 루미놀 기반 화학발광법으로 쉽고 안정적으로 검출할 수 있습니다. 화학발광은 루미놀 또는 그 유도체(예: L-012)가 촉매의 작용으로 ROS와 산화환원 반응을 겪는 광자 생성 반응입니다. 이 논문은 벼 조직에서 PAMP 추출 시 실시간으로 아포플라스트 ROS 생성을 감지하기 위해 최적화된 L-012 기반 화학발광 방법을 설명합니다. 이 방법은 확실하게 통제된 조건에서 쉽고, 안정적이며, 표준화되고, 재현성이 높습니다.
Introduction
활성산소종(ROS)은 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2–)과 그 유도체, 하이드록실 라디칼(OH–), 과산화수소, 일중항 산소 또는 산화환원 반응의 산물을 포함한 일련의 화학적 활성 산소 유도체로 구성되며, 색소체와 엽록체, 미토콘드리아, 퍼옥시좀 및 기타 세포 이하 위치에서 지속적으로 생성됩니다1 . ROS는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하며 모든 식물에 필수적입니다 2,3,4. ROS 기능의 광범위한 스펙트럼은 성장과 발달의 조절에서 비생물적 및 생물학적 스트레스의 인식에 이르기까지 다양합니다 5,6,7,8.
식물 면역계에서 식물 세포 원형질막-국소화된 수용체-소위 패턴 인식 수용체(PRR)-병원체 유래 화학 물질-병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 인식합니다. 이 인식은 칼슘 유입, ROS 버스트 및 MAPK 캐스케이드를 포함한 일련의 빠른 면역 반응을 유발합니다. 따라서 이 면역 층을 PAMP 유발 면역(PTI)이라고 합니다. ROS 버스트는 특징적인 PTI 반응이며, 그 결정은 PTI 관련 연구 9,10에 널리 적용됩니다. PAMP에 의해 유발된 ROS 생성은 세포질 NADPH 또는 NADH에서 세포외 산소로 전자를 전달하여 슈퍼옥사이드(O2–)를 생성하고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)에 의해 자발적으로 과산화수소(H2O2)로 전환되는 원형질막 상주(Plasma membrane-resident NADPH oxidase) 또는 호흡 버스트 산화효소 상동체(RBOH) 계열 단백질에 기인합니다8 . PAMP 유발 ROS 버스트는 매우 빠르며 PAMP 치료 후 몇 분 만에 나타나고 ~10-12분에 최고조에 달합니다. ROS 분자의 대다수는 과산화수소(H2O2)를 포함하며, 이는 화학발광 분석법으로 쉽고 안정적으로 검출할 수 있습니다.
화학발광에서, 화학발광 시약은 촉매의 작용하에 활성 산소와 반응하여 여기 상태 중간체들을 생성한다. 그런 다음 제품의 전자는 비방사 전이를 통해 바닥 상태로 돌아가 광자를 방출합니다. 일반적인 화학발광 시약에는 루미놀 및 L-012가 포함되며, 루미놀은 응용 분야11,12,13을 지배합니다. 그러나 L-012는 루미놀에 비해 중성 또는 중성에 가까운 pH 조건에서 발광 효율이 훨씬 높기 때문에 더 많은 연구자들이 ROS 생성을 감지하기 위해 L-012를 선택하고 있습니다.
이 논문은 벼(Oryza sativa) 조직-잎 디스크 및 외피에서 PAMP를 추출한 후 ROS 생산의 실시간 검출을 위해 L-012를 기반으로 최적화된 화학발광 방법을 설명합니다. 여기에 제공된 방법은 간단하고 안정적이며 표준화되어 있으며 다양한 실험 요구 사항을 충족할 수 있도록 적응성이 뛰어납니다. 이 방법으로 얻은 데이터는 확고하게 제어된 조건에서 재현성이 높습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구의 목적은 벼 조직에서 PAMP에 대한 반응으로 초기 ROS 생산을 정량화하는 매우 효율적인 방법을 확립하는 것이었습니다. 이 방법은 처리된 벼 조직에서 생성된 아포플라스트 ROS의 실시간 측정을 위한 표준화된 절차를 제공합니다. 이 방법은 작동이 간단하고 비용이 저렴하며 구성이 명확하고 상용 키트와 무관합니다. 이 방법을 사용하여 연구자들은 식물이 생물학적 또는 비생물적 스트레?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Shanghai Natural Science Foundation(보조금 번호: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University(Agri-X 프로그램, 보조금 번호:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds(보조금 번호: ZXWH2150201/001)의 보조금으로 Jiangbo Fan에, Shanghai Jiao Tong Univesity의 의료-공학 협력 프로젝트(보조금 번호: 21X010301734)가 Can Li에 지원했습니다.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referências
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