På grund af sin alsidige anvendelse som modelart inden for forskellige fagområder er der behov for et genetisk transformationsværktøjssæt i smalbladet plantain (Plantago lanceolata). Her præsenteres ved hjælp af Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation en protokol, der resulterer i stabile transgene linjer med en transformationseffektivitet på 20%.
Arter i slægten Plantago har flere unikke træk, der har ført til, at de er tilpasset som modelplanter inden for forskellige fagområder. Manglen på et genetisk manipulationssystem forhindrer imidlertid en grundig undersøgelse af genfunktionen, hvilket begrænser alsidigheden af denne slægt som model. Her præsenteres en transformationsprotokol for Plantago lanceolata, den mest almindeligt studerede Plantago-art. Ved anvendelse af Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation blev 3 uger gamle rødder af aseptisk dyrkede P. lanceolata-planter inficeret med bakterier, inkuberet i 2-3 dage og derefter overført til et skudinduktionsmedium med passende antibiotikavalg. Skud opstod typisk fra mediet efter 1 måned, og rødder udviklede sig 1-4 uger efter, at skuddene blev overført til rodinduktionsmediet. Planterne blev derefter akklimatiseret til et jordmiljø og testet for tilstedeværelsen af et transgen ved hjælp af β-glucuronidase (GUS) reporter-assay. Transformationseffektiviteten af den nuværende metode er ~ 20%, med to transgene planter, der dukker op pr. 10 rodvæv transformeret. Etablering af en transformationsprotokol for smalbladet plantain vil lette vedtagelsen af denne plante som en ny modelart i forskellige områder.
Konceptet med at bruge modelarter til at undersøge flere aspekter af plantebiologi opstod med den udbredte anvendelse af Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis blev oprindeligt valgt, fordi den deler funktioner med mange andre blomstrende planter og har flere træk, der gør det praktisk at studere i et laboratoriemiljø, såsom at være lille og have en kort generationscyklus. Den store mængde forskningsartikler, der er offentliggjort med det som emne, sammen med dets lille genomstørrelse og lette genetiske transformation2, gør det muligt for det at fortsætte som en udbredt eksperimentel organisme. Arabidopsis kan dog begrænses som model for arter med forskellige egenskaber eller unikke træk3. Dette har ført til udviklingen af nye modelsystemer, såsom majs (Zea mays), en vigtig plante for udviklingsgenetik i monocots4, og tomat (Solanum lycopersicum), som er en vigtig model for evolutionære undersøgelser, frugtudvikling og produktion, og er en god repræsentation for vegetabilske afgrøder5. En metode til genetisk transformation er en forudsætning for, at en planteart kan fungere som modelorganisme2. En Agrobacterium tumefaciens-medieret transformation er et pålideligt værktøj inden for plantebiologi; det er blevet brugt til at omdanne nogle få modelarter og større afgrøder, herunder tobak (Nicotiana tabacum)6, ris (Oryza sativa)7, bomuld (Gossypium hirsutum)8, sojabønne (Glycine max)9, kartoffel (Solanum tuberosum)10 og raps (Brassica napus)11. Plantearter er meget variable i, hvor godt de reagerer på A. tumefaciens-infektion, og transformationsprotokoller skal ofte skræddersys individuelt til hver art 6,12.
Slægten Plantago omfatter i alt 256 plantearter, bredt fordelt over hele verden13. Arterne i denne slægt har ofte unikke egenskaber, der gør dem ønskelige som modelarter til undersøgelse af genetik, økologi, stressfysiologi, sekundære metabolitter, medicinalkemi, plante-mikrobe-interaktioner, planteudvikling og evolution. Plantago lanceolata , også kaldet smalbladet eller ribwort plantain, har været en populær plante af interesse siden det 19.århundrede , da den først blev brugt til at beskrive fænomenet mandlig sterilitet14. Ligesom andre planter af sin slægt er den blevet brugt i undersøgelser på tværs af forskellige forskningsområder. For nylig er det blevet foreslået som en model for vaskulær biologi, da dets vaskulære væv let kan indsamles15. P. lanceolata er den mest almindeligt undersøgte art i slægten Plantago; en artikel fra 2021 rapporterede, at der var >1,400 publikationer, herunder eller relateret til denne art på det tidspunkt16, og yderligere 102 artikler er blevet offentliggjort siden begyndelsen af 2022, ifølge en PubMed-søgning foretaget den 9.december th 2022. Den næstmest undersøgte plante i slægten, P. major , er kun genstand for 414 artikler, når den søges efter de samme kriterier på samme dato.
På trods af forskningsinteressen i P. lanceolata er undersøgelser, især af karakterisering af genfunktion, ofte begrænset af manglen på et genetisk manipulationsværktøjssæt til arten. Pommerrienig et al. gjorde en indsats for at udvikle en transformationsprotokol for P. major ved hjælp af en blomsterdypteknik17. Denne metode kan imidlertid ikke anvendes på P. lanceolata på grund af den mandlige sterilitet, der er karakteristisk for denne art18,19. Så vidt vi ved, er der ingen eksisterende protokol til transformation af P. lanceolata.
Denne undersøgelse præsenterer en simpel protokol for A. tumefaciens-medieret transformation af P. lanceolata. Ved at målrette rodvæv kan fuldt voksne transgene planter genereres inden for 3 måneder efter transformation.
Manglen på en transformationsprotokol for planter i slægten Plantago begrænser brugen af disse planter som modeller, især når forskere er interesserede i at udforske genfunktioner. P. lanceolata blev valgt til at udvikle en genetisk transformationsprotokol, fordi det er den mest almindeligt undersøgte plante i sin slægt16. Den protokol, der er udviklet, vil sandsynligvis blive brugt som et værktøj til yderligere at fremme undersøgelser relateret til vaskulær biologi, økologi, plante-insektinteraktioner og abiotisk stressfysiologi.
Den præsenterede protokol skitserer klart trin, der giver en bruger mulighed for at opnå transgene planter. Ud over P. lanceolatas evne til at trives i et vævskulturmiljø bidrog flere faktorer til succesen med vores transformationsmetode. For det første blev vigtigheden af at anvende sterilt planterodvæv af høj kvalitet til transformation observeret. Rødder havde de højeste transformationshastigheder, når de blev taget fra 3-4 uger gamle planter og fremstod grønne eller lysehvide. Rødder taget fra kasser med en hvilken som helst mængde bakteriel eller svampeforurening resulterede ofte i forurenede skydekulturer, og ældre rødder, der syntes brune, resulterede ikke i vellykket transformation. Rodvæv var den mest effektive vævstype til transformation ved hjælp af den nuværende metode, da blad- og petiolevæv ikke havde succes med at udvikle skud.
En anden vigtig observation var, at den optimale metode til indsamling af rodvæv til transformation var at placere friskskåret rodmateriale i sterilt vand. Dette trin tillod effektivt rodmateriale at forblive hydreret, mens resten af vævet blev opsamlet, da rødder har tendens til at tørre hurtigt ud, når de fjernes fra deres vækstbeholdere. Dette trin bidrog også til at øge succesraten for transformationen, fordi det tillod flere rødder at blive inkuberet i bakterierne ad gangen.
Denne protokol kan ændres ved at reducere den tid, hvor rodvævet inkuberer i cokulturmediet til 2 dage. Det blev observeret, at en 2 eller 3 dages inkubationstid er tilstrækkelig til at tillade infektion, der resulterer i skudinitialer. Imidlertid anbefales længere inkubationstider ikke, da det blev observeret, at fraværet af en antibiotikahæmmer i medierne ofte resulterer i A. tumefaciens overvækst, som kan dræbe det nye væv.
En begrænsning ved denne undersøgelse er manglen på tilgængelige data om ydeevnen af andre metoder eller arter af A. tumefaciens i P. lanceolata transformation til sammenligning. Så vidt vi ved, er denne protokol ny. Under de indledende forsøg blev der konstateret en høj transformationseffektivitet med A. tumefaciens GV3101, og vi fokuserede på at forfine teknikken ved hjælp af denne stamme i stedet for at eksperimentere med andre stammer. Vores transformationseffektivitet på 20% er relativt høj for plantetransformation – mange konventionelle metoder anser alt >1% for at være vellykket26,27,28. Brug af en anden stamme af A. tumefaciens, såsom A. rhizogenes, kendt for dets anvendelse i rodtransformation i flere arter 29,30,31, kan imidlertid resultere i en endnu højere succesrate. Yderligere eksperimenter ville være nødvendige for at vurdere virkningen af at bruge andre stammer til at fremme øget transformationseffektivitet i P. lanceolata.
Den vellykkede transformation af P. lanceolata vil sandsynligvis gavne mange fagområder. Den høje transformationseffektivitet og den hurtige vækst af planten i vævskulturmedier gør P. lanceolata til en mulig kandidat til genfunktionsundersøgelser15.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 til C.Z. og Y.Z.).
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
ddH2O | |||
DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
Glycine | Sigma | 241261 | |
Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |