अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों में एक मॉडल प्रजाति के रूप में इसके बहुमुखी अनुप्रयोग के कारण, नैरोलीफ प्लांटेन (प्लांटागो लांसोल्टा) में आनुवंशिक परिवर्तन टूलकिट की आवश्यकता है। यहां, एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स-मध्यस्थता परिवर्तन का उपयोग करके, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप 20% की परिवर्तन दक्षता के साथ स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनें होती हैं।
जीनस प्लांटागो में प्रजातियों में कई अद्वितीय लक्षण हैं जिनके कारण उन्हें अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों में मॉडल पौधों के रूप में अनुकूलित किया गया है। हालांकि, आनुवंशिक हेरफेर प्रणाली की कमी जीन फ़ंक्शन की गहन जांच को रोकती है, एक मॉडल के रूप में इस जीनस की बहुमुखी प्रतिभा को सीमित करती है। यहां, प्लांटागो लांसोलाटा के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जो सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली प्लांटागो प्रजातियां हैं। एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियन्स-मध्यस्थता परिवर्तन का उपयोग करते हुए, सड़न से विकसित पी. लांसोलाटा पौधों की 3 सप्ताह पुरानी जड़ों को बैक्टीरिया से संक्रमित किया गया, 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया गया, और फिर उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ शूट प्रेरण माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया। शूट आमतौर पर 1 महीने के बाद माध्यम से उभरे, और अंकुरों को रूट इंडक्शन माध्यम में स्थानांतरित करने के 1-4 सप्ताह बाद जड़ें विकसित हुईं। पौधों को तब मिट्टी के वातावरण में अनुकूलित किया गया था और β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) रिपोर्टर परख का उपयोग करके ट्रांसजीन की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया था। वर्तमान विधि की परिवर्तन दक्षता ~ 20% है, जिसमें प्रति 10 जड़ ऊतकों में दो ट्रांसजेनिक पौधे उभर रहे हैं। नैरोलीफ प्लांटेन के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल स्थापित करने से विभिन्न क्षेत्रों में इस पौधे को एक नई मॉडल प्रजाति के रूप में अपनाने की सुविधा मिलेगी।
पौधों के जीव विज्ञान के कई पहलुओं की जांच के लिए मॉडल प्रजातियों का उपयोग करने की अवधारणा एराबिडोप्सिस थैलियाना1 के व्यापक उपयोग के साथ उभरी। एराबिडोप्सिस को शुरू में चुना गया था क्योंकि यह कई अन्य फूलों के पौधों के साथ विशेषताओं को साझा करता है और इसमें कई लक्षण होते हैं जो प्रयोगशाला वातावरण में अध्ययन करना सुविधाजनक बनाते हैं, जैसे कि छोटा होना और छोटी पीढ़ी का चक्र होना। एक विषय के रूप में इसके साथ प्रकाशित शोध पत्रों की बड़ी मात्रा, इसके छोटे जीनोम आकार और आनुवंशिक परिवर्तनमें आसानी के साथ, इसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक जीव के रूप में बने रहने में सक्षम बनाती है। हालांकि, एराबिडोप्सिस को विभिन्न विशेषताओं या अद्वितीयलक्षणों वाली प्रजातियों के लिए एक मॉडल के रूप में सीमित किया जा सकता है। इसने नए मॉडल सिस्टम के विकास को प्रेरित किया है, जैसे कि मक्का (ज़िया मेस), मोनोकोट4 में विकासात्मक आनुवंशिकी के लिए एक महत्वपूर्ण पौधा, और टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम), जो विकासवादी अध्ययन, फल विकास और उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है, और सब्जीफसलों के लिए एक अच्छा प्रतिनिधित्व है। आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक विधि एक पौधे की प्रजातियों के लिए एक मॉडल जीव के रूप में सेवा करने के लिए एक शर्त है। एक एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियंस-मध्यस्थता परिवर्तन पौधे जीव विज्ञान में एक विश्वसनीय उपकरण है; इसका उपयोग कुछ मॉडल प्रजातियों और प्रमुख फसलों को बदलने के लिए किया गया है, जिसमें तंबाकू (निकोटियाना टैबाकम) 6, चावल (ओरीज़ा सैटिवा) 7, कपास (गोसिपियम हिरसुटम) 8, सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स)9, आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) 10, और कैनोला (ब्रासिका नेपस)11 शामिल हैं। पौधों की प्रजातियां अत्यधिक परिवर्तनशील होती हैं कि वे ए. टुमेफेसिएन्स संक्रमण का कितनी सफलतापूर्वक जवाब देते हैं, और परिवर्तन प्रोटोकॉल को अक्सर प्रत्येक प्रजाति 6,12 के लिए व्यक्तिगत रूप से तैयार करने की आवश्यकता होती है।
जीनस प्लांटागो में कुल 256 पौधों की प्रजातियां शामिल हैं, जो दुनिया भर में व्यापक रूप से वितरितहैं। इस जीनस की प्रजातियों में अक्सर अनूठी विशेषताएं होती हैं जो उन्हें आनुवंशिकी, पारिस्थितिकी, तनाव शरीर विज्ञान, माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, औषधीय रसायन विज्ञान, पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन, पौधे के विकास और विकास के अध्ययन के लिए मॉडल प्रजातियों के रूप में वांछनीय बनाती हैं। प्लांटागो लांसोलाटा, जिसे नैरोलीफ या रिबवर्ट प्लांटेन भी कहा जाता है, 19वीं शताब्दी के बाद से रुचि का एक लोकप्रिय पौधा रहा है, जब इसका उपयोग पहली बार पुरुष बाँझपन14 की घटना का वर्णन करने के लिए किया गया था। इसके जीनस के अन्य पौधों की तरह, इसका उपयोग विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में अध्ययन में किया गया है। हाल ही में, इसे संवहनी जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के रूप में प्रस्तावित किया गया है, क्योंकि इसके संवहनी ऊतक को आसानी से एकत्र किया जा सकताहै। लांसोलाटा जीनस प्लांटागो में सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली प्रजाति है; 2021 के एक लेख में बताया गया है कि उस समय16 > इस प्रजाति सहित या उससे संबंधित > 1,400 प्रकाशन थे, और 9 दिसंबर 2022 को किए गए PubMed खोज के अनुसार, 2022 की शुरुआत से अतिरिक्त 102 लेख प्रकाशित किए गए हैं। जीनस में अगला सबसे अधिक अध्ययन किया गया पौधा, पी मेजर, एक ही तारीख पर समान मानदंडों का उपयोग करके खोजे जाने पर केवल 414 लेखों का विषय है।
लांसोलाटा में अनुसंधान रुचि के बावजूद, अध्ययन, विशेष रूप से जीन फ़ंक्शन लक्षण वर्णन पर, अक्सर प्रजातियों के लिए आनुवंशिक हेरफेर टूलकिट की कमी से सीमित होते हैं। पोमेरिनिग एट अल ने पुष्प डिप तकनीक17 का उपयोग करके पी मेजर के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल विकसित करने के प्रयास किए। हालांकि, इस प्रजाति18,19 की नर बाँझपन विशेषता के कारण इस विधि को पी लांसोलाटा पर लागू नहीं किया जा सकता है। हमारे ज्ञान के लिए, पी लांसोलाटा के परिवर्तन के लिए कोई मौजूदा प्रोटोकॉल नहीं है।
यह अध्ययन पी. लांसोल्टा के ए. टुमेफेसिएन्स-मध्यस्थता परिवर्तन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। जड़ ऊतकों को लक्षित करके, पूरी तरह से विकसित ट्रांसजेनिक पौधों को परिवर्तन के 3 महीने के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है।
जीनस प्लांटागो में पौधों के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल की कमी इन पौधों के उपयोग को मॉडल के रूप में सीमित करती है, खासकर जब शोधकर्ता जीन कार्यों की खोज में रुचि रखते हैं। लांसोलाटा को आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए चुना गया था क्योंकि यह अपने जीनस16 का सबसे अधिक अध्ययन किया जाने वाला पौधा है। जो प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, उसका उपयोग संवहनी जीव विज्ञान, पारिस्थितिकी, पौधे-कीट इंटरैक्शन और अजैविक तनाव शरीर विज्ञान से संबंधित अध्ययनों को आगे बढ़ाने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाएगा।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से उन चरणों को रेखांकित करता है जो उपयोगकर्ता को ट्रांसजेनिक पौधों को प्राप्त करने की अनुमति देते हैं। एक ऊतक संस्कृति वातावरण में पनपने के लिए पी लांसोलाटा की क्षमता के अलावा, कई कारकों ने हमारी परिवर्तन विधि की सफलता में योगदान दिया। सबसे पहले, परिवर्तन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले, बाँझ पौधे की जड़ ऊतक का उपयोग करने का महत्व देखा गया था। जड़ों में उच्चतम परिवर्तन दर थी जब उन्हें 3-4 सप्ताह पुराने पौधों से लिया गया था, और हरे या हल्के सफेद दिखाई दिए थे। बैक्टीरिया या फंगल संदूषण की किसी भी मात्रा के साथ बक्से से ली गई जड़ें अक्सर दूषित शूटिंग संस्कृतियों के परिणामस्वरूप होती हैं, और भूरे रंग की दिखाई देने वाली पुरानी जड़ें सफल परिवर्तन का परिणाम नहीं देती हैं। जड़ ऊतक वर्तमान विधि का उपयोग करके परिवर्तन के लिए सबसे कुशल ऊतक प्रकार था, क्योंकि पत्ती और पेटियोल ऊतक शूट विकसित करने में असफल रहे थे।
एक और महत्वपूर्ण अवलोकन यह था कि परिवर्तन के लिए जड़ ऊतक एकत्र करने का इष्टतम तरीका बाँझ पानी में ताजा कटी हुई जड़ सामग्री रखना था। इस कदम ने प्रभावी रूप से जड़ सामग्री को हाइड्रेटेड रहने की अनुमति दी, जबकि शेष ऊतक एकत्र किया गया था, क्योंकि जड़ें अपने विकास कंटेनरों से हटाए जाने पर जल्दी से सूख जाती हैं। इस कदम ने परिवर्तन की सफलता दर को बढ़ाने में भी मदद की, क्योंकि इसने एक समय में बैक्टीरिया में अधिक जड़ों को इनक्यूबेट करने की अनुमति दी।
इस प्रोटोकॉल को उस समय को कम करके संशोधित किया जा सकता है जो जड़ ऊतक सह-संस्कृति मीडिया में 2 दिनों तक सेते हैं। यह देखा गया कि 2 या 3 दिन की इनक्यूबेशन अवधि संक्रमण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है जिसके परिणामस्वरूप शूट आद्याक्षर होते हैं। हालांकि, लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि यह देखा गया था कि मीडिया में एंटीबायोटिक अवरोधक की अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप अक्सर ए ट्यूमेफेसियन्स अतिवृद्धि होती है , जो उभरते ऊतक को मार सकती है।
इस अध्ययन की एक सीमा तुलना के लिए पी. लांसोलाटा परिवर्तन में ए. टुमेफेसियन्स के अन्य तरीकों या प्रजातियों के प्रदर्शन पर उपलब्ध आंकड़ों की कमी है। हमारी जानकारी के लिए, यह प्रोटोकॉल नया है। प्रारंभिक परीक्षणों के दौरान, ए. टुमेफेसिएन्स जीवी 3101 के साथ एक उच्च परिवर्तन दक्षता का उल्लेख किया गया था, और हमने अन्य उपभेदों के साथ प्रयोग करने के बजाय इस तनाव का उपयोग करके तकनीक को परिष्कृत करने पर ध्यान केंद्रित किया। पौधे परिवर्तन के लिए 20% की हमारी परिवर्तन दक्षता अपेक्षाकृत अधिक है- कई पारंपरिक तरीके किसी भी चीज़ को सफल मानते हैं >1% सफल 26,27,28। हालांकि, ए. टुमेफेसिएन्स के एक अन्य तनाव का उपयोग करना, जैसे कि ए राइजोजेन्स, जो कई प्रजातियों 29,30,31 में जड़ परिवर्तन में इसके उपयोग के लिए जाना जाता है, के परिणामस्वरूप और भी अधिक सफलता दर हो सकती है। पी लांसोलाटा में बढ़ी हुई परिवर्तन दक्षता को बढ़ावा देने के लिए अन्य उपभेदों का उपयोग करने के प्रभाव का आकलन करने के लिए आगे के प्रयोग की आवश्यकता होगी।
लांसोलाटा के सफल परिवर्तन से अध्ययन के कई क्षेत्रों को लाभ होगा। उच्च परिवर्तन दक्षता, और ऊतक संवर्धन मीडिया में पौधे की तेजी से वृद्धि, पी लांसोलाटा को जीन फ़ंक्शन अध्ययन15 के लिए एक व्यवहार्य उम्मीदवार बनाती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (EDGE IOS-1923557 से C.Z. और Y.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था।
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
ddH2O | |||
DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
Glycine | Sigma | 241261 | |
Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |