יישום של מערכת חכמה לבדיקת רגישות מיקרוביאלית בתפוקה גבוהה / בדיקת פאגים ומדד Lar של עמידות מיקרוביאלית
Summary
כאן אנו מציגים את העיקרון, המבנה וההוראה של המערכת החכמה לבדיקת רגישות מיקרוביאלית בתפוקה גבוהה/מערכת סינון פאגים. היישום שלה מודגם על ידי שימוש בסלמונלה שבודדה מעופות בשאנדונג, סין, כדוגמה. מדד Lar מחושב, ומשמעותו בהערכת עמידות מיקרוביאלית נידונה באופן מקיף.
Abstract
כדי לשפר את היעילות של בדיקות רגישות מיקרוביאלית (AST) ובדיקות פאגים בתפוקה גבוהה עבור חיידקים עמידים ולהפחית את עלות האיתור, פותחה מערכת סינון חכמה של AST/פאגים בתפוקה גבוהה, הכוללת חיסון מטריצה של 96 נקודות, ממיר רכישת תמונה ותוכנה מתאימה, על פי קריטריוני AST ונקודות השבירה של התנגדות (R) שגובשו על ידי מכון התקנים הקליני והמעבדה (CLSI). AST וסטטיסטיקה של התפלגות ריכוז מעכב מינימלי (MIC) (מ-R/8 עד 8R) של 1,500 זני סלמונלה שבודדו מעופות בשאנדונג, סין, כנגד 10 חומרים אנטי-מיקרוביאליים בוצעו על ידי מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה. מדד Lar, שמשמעותו “פחות אנטיביוזה, פחות עמידות ושאריות עד מעט אנטיביוזה”, התקבל על ידי חישוב הממוצע המשוקלל של כל מיקרופון וחלוקה ב-R. גישה זו משפרת את הדיוק בהשוואה לשימוש בשכיחות העמידות כדי לאפיין את מידת העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) של זנים עמידים מאוד. עבור זני סלמונלה עם AMR גבוה, פאגים ליטיים נבדקו ביעילות מספריית הפאגים על ידי מערכת זו, וספקטרום הליזיס חושב ונותח. התוצאות הראו כי מערכת סינון AST/פאגים חכמה בעלת תפוקה גבוהה הייתה ניתנת להפעלה, מדויקת, יעילה מאוד, זולה וקלה לתחזוקה. בשילוב עם מערכת ניטור עמידות מיקרוביאלית וטרינרית בשאנדונג, המערכת התאימה למחקר מדעי ולזיהוי קליני הקשור ל- AMR.
Introduction
מכיוון שחומרים אנטי-מיקרוביאליים נמצאים בשימוש נרחב למניעת מחלות זיהומיות חיידקיות, עמידות מיקרוביאלית (AMR) הפכה לבעיה עולמית של בריאות הציבור1. המאבק ב-AMR הוא המשימה העיקרית הנוכחית של ניטור AMR של פתוגנים אפידמיולוגיים וטיפול סינרגטי בחומרים אנטי-מיקרוביאליים רגישים ובקטריופאג’ים ליטיים2.
בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית במבחנה (AST) היא עמוד התווך לניטור הטיפול ולזיהוי רמת AMR. זהו חלק חשוב בפרמקולוגיה מיקרוביאלית והבסיס הקריטי לתרופות קליניות. המכון לתקנים קליניים ומעבדתיים (CLSI) של ארצות הברית והוועדה האירופית לבדיקות רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) ניסחו ותיקנו קריטריונים בינלאומיים של AST ושינו והשלימו ללא הרף שיטות AST ואת נקודות השבירה כדי לקבוע את המיקרופון של שילוב מסוים של “אורגניזם-סוכן מיקרוביאלי” כרגיש (S), עמיד (R) או ביניים (I)3, 4.
משנות השמונים ועד שנות התשעים, מכשירים אוטומטיים לדילול מרק מיקרו פותחו במהירות ויושמו בפרקטיקה קלינית, עם דוגמאות כולל אלפרד 60AST, VITEK System, PHOENIXTM ו- Cobasbact 5,6,7. עם זאת, מכשירים אלה היו יקרים, דרשו חומרים מתכלים בעלות גבוהה, וטווחי הגילוי שלהם תוכננו עבור תרופות קליניותלחולים 5,6,7. מסיבות אלה, הם אינם מתאימים לבדיקה קלינית וטרינרית ולאיתור כמויות גדולות של זנים עמידים במיוחד. במחקר זה, מערכת סינון חכמה של AST/פאגים בעלת תפוקה גבוהה, הכוללת מחסנים של מטריצת 96 נקודות (איור 1), ממיר רכישת תמונה (איור 2) ותוכנה מקבילה8, פותחה כדי לבצע AST עבור קבוצה של זני חיידקים נגד מספר גורמים אנטי-מיקרוביאליים בו זמנית בשיטת דילול אגר. יתר על כן, המערכת שימשה גם כדי לזהות ולנתח את דפוסי הליזה של פאגים כנגד חיידקים עמידים מיקרוביאלית9, ופאגים ליטיים נבחרו ביעילות מספריית הפאגים. מערכת זו נמצאה יעילה, משתלמת וקלה לתפעול.
איור 1: תרשים מבני של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות. 1: צלחת סיכת חיסון; 2: ספק סלולרי; 3: בלוק זרעים; 4: צלחת מודגרת; 5: בסיס; 6: ידית הפעלה; 7: הגבל את הסיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמה מבנית של ממיר רכישת התמונות. 1: מעטפת; 2: מסך תצוגה; 3: חדר רכישת תמונות; 4: בסיס לוח איתור; 5: לוח איתור במחסן ומחוצה לו; 6: לוח בקרה; 7: מכשיר המרה לרכישת תמונות; 8: מקור אור; 9: סורק תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת דילול אגר כבר מבוססת היטב בשימוש נרחב. העיקרון של מערכת AST בתפוקה גבוהה היה זה של שיטת דילול אגר. אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול היה העברה מדויקת בתפוקה גבוהה של 96 חיסונים בו זמנית, שבוצעה מספר פעמים ברציפות. כדי להשלים את השלב הקריטי הזה, הפינים של חיסון המטריצה בן 96 הנקודות היו אחידים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר והפיתוח הלאומי (2019YFA0904003); מערכת תעשייתית חקלאית מודרנית במחוז שאנדונג (SDAIT-011-09); פרויקט אופטימיזציה של פלטפורמת שיתוף פעולה בינלאומי (CXGC2023G15); משימות חדשנות עיקריות של פרויקט חדשנות מדעית וטכנולוגית חקלאית של האקדמיה למדעי החקלאות שאנדונג, סין (CXGC2023G03).
Materials
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
- Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
- Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
