Ex Vivo Polivinil Alkol Bazlı Kültürlerde Fare Hematopoetik Kök Hücrelerinin Genleşmesi ve Genetik Manipülasyonu
Summary
Burada, ex vivo polivinil alkol bazlı genişleme kullanarak fare hematopoetik kök hücre kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve analiz etmek için bir protokol ve ayrıca lentiviral transdüksiyon ve elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme yöntemleri sunulmaktadır.
Abstract
Kendini yenileyen multipotent hematopoetik kök hücreler (HSC’ler), yaşam boyu hematopoezi destekleme ve nakil sonrası tüm kan sistemini yeniden oluşturma yetenekleri nedeniyle önemli bir hücre tipidir. HSC’ler, bir dizi kan hastalığı için küratif tedaviyi temsil eden kök hücre nakli tedavilerinde klinik olarak kullanılmaktadır. Hem HSC aktivitesini ve hematopoezi düzenleyen mekanizmaların anlaşılmasına hem de yeni HSC tabanlı tedavilerin geliştirilmesine büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, HSC’lerin ex vivo stabil kültürü ve genişlemesi, bu kök hücrelerin izlenebilir bir ex vivo sistemde incelenmesinde büyük bir engel olmuştur. Yakın zamanda, nakledilebilir fare HSC’lerinin uzun vadeli ve büyük ölçekli genişlemesini ve bunları genetik olarak düzenleme yöntemlerini destekleyebilecek bir polivinil alkol bazlı kültür sistemi geliştirdik. Bu protokol, elektroporasyon ve lentiviral transdüksiyon yoluyla fare HSC’lerini kültüre alma ve genetik olarak manipüle etme yöntemlerini açıklar. Bu protokolün HSC biyolojisi ve hematopoez ile ilgilenen çok çeşitli deneysel hematologlar için yararlı olması beklenmektedir.
Introduction
Hematopoetik sistem, memelilerde, oksijen tedarikinden patojenlerle savaşmaya, özel kan ve bağışıklık hücresi tiplerine kadar bir dizi temel süreci destekler. Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC’ler) tarafından sürdürülen kan sistemi homeostazını desteklemek için sürekli kan üretimi (hematopoez) gereklidir1. En ilkel hematopoetik hücre, kendini yenileme ve çok soylu farklılaşma için benzersiz kapasitelere sahip olan hematopoetik kök hücredir (HSC) 2,3. Bu, esas olarak yetişkin kemik iliği4’te bulunan nadir bir hücre popülasyonudur ve burada yaklaşık her 30.000 hücrede sadece bir sıklıkta meydana gelir. HSC’lerin yaşam boyu hematopoezi desteklediği ve hematolojik stres sonrası hematopoezin yeniden kurulmasına yardımcı olduğu düşünülmektedir. Bu kapasiteler aynı zamanda HSC’lerin ışınlanmış bir alıcıya transplantasyonu takiben tüm hematopoetik sistemi stabil bir şekilde yeniden oluşturmasına izin verir5. Bu, bir HSC’nin fonksiyonel tanımını temsil eder ve aynı zamanda bir dizi kan ve bağışıklık hastalığı için iyileştirici bir tedavi olan HSC transplantasyon tedavisinin bilimsel temelini oluşturur6. Bu nedenlerden dolayı, HSC’ler deneysel hematolojinin ana odak noktasıdır.
Geniş bir araştırma odağına rağmen, HSC’leri ex vivo7’yi istikrarlı bir şekilde genişletmek zor olmaya devam etmiştir. Kısa bir süre önce fare HSC’leri8 için ilk uzun vadeli ex vivo genişletme kültürü sistemini geliştirdik. Bu yaklaşım, nakledilebilir HSC’leri 4 haftalık bir kültür boyunca 234-899 kat genişletebilir. Alternatif yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, protokoldeki en büyük değişiklik, serum albümininin çıkarılması ve sentetik bir polimerle değiştirilmesiydi. Polivinil alkol (PVA), fare HSC kültürleri8 için optimal bir polimer olarak tanımlanmıştır ve şimdi diğer hematopoetik hücre tipleri9’u kültürlemek için de kullanılmıştır. Bununla birlikte, Soluplus (bir polivinil kaprolaktam-asetat-polietilen glikol greft kopolimeri) adı verilen başka bir polimer de yakın zamanda tanımlanmıştır ve bu da klonal HSC genişlemesini iyileştirdiği görülmektedir10. Polimerlerin kullanımından önce, fetal sığır serumu, sığır serum albümin fraksiyonu V veya rekombinant serum albümini şeklinde serum albümini kullanıldı, ancak bunlar HSC genişlemesi için sınırlı desteğe sahipti ve sadece kısa süreli (~ 1 hafta) ex vivo kültürü destekledi7. Bununla birlikte, HSC’leri sessiz bir durumda tutan HSC kültür protokollerinin daha uzun bir ex vivo kültür süresini destekleyebileceği unutulmamalıdır11,12.
Diğer kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında, PVA tabanlı kültürlerin önemli bir avantajı, üretilebilecek hücre sayısı ve protokolün HSC’leri ex vivo izlemek için kullanılabileceği sürenin uzunluğudur. Bu, deneysel hematoloji alanında, fare başına izolalanabilir düşük HSC sayısı (sadece birkaç bin) ve HSC’leri in vivo olarak zaman içinde izlemenin zorluğu gibi çeşitli engellerin üstesinden gelir. Bununla birlikte, bu kültürlerin HSC proliferasyonunu uyardığını, in vivo HSC havuzunun ise ağırlıklı olarak kararlı bir durumda sessiz olduğunu hatırlamak önemlidir13. Ek olarak, kültürler HSC’ler için seçici olmasına rağmen, ek hücre tipleri zamanla kültürlerle birlikte birikir ve nakledilebilir HSC’ler 1 ay sonra 34 hücreden sadece birini temsil eder. Miyeloid hematopoetik progenitör hücreler bu HSC kültürlerinde başlıca kontamine edici hücre tipi gibi görünmektedir8. Bununla birlikte, bu kültürleri heterojen hücre popülasyonlarından HSC’leri zenginleştirmek için kullanabiliriz (örneğin, c-Kit + kemik iliği HSPC’leri14). Ayrıca genetik manipülasyon14,15,16 için HSC’lerin transdüksiyonunu veya elektroporasyonunu destekler. Heterojen kültürlü HSPC popülasyonundan HSC’lerin tanımlanmasına yardımcı olmak için, CD201 (EPCR) yakın zamanda CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Soy fraksiyonu ile sınırlı nakledilebilir HSC’ler ile yararlı bir ex vivo HSC belirteci 10,17,18 olarak tanımlanmıştır.
Bu protokol, PVA tabanlı fare HSC genişleme kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve değerlendirmek için kullanılan yöntemleri ve ayrıca elektroporasyon veya lentiviral vektör transdüksiyonu kullanarak bu kültürlerde genetik manipülasyon protokollerini açıklar. Bu yöntemlerin bir dizi deneysel hematolog için yararlı olması beklenmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün HSC biyolojisini, hematopoezi ve hematolojiyi daha genel olarak araştırmak için yararlı bir yaklaşım sunduğunu umuyoruz. FACS saflaştırılmış HSC’ler8 için PVA tabanlı kültür yönteminin ilk geliştirilmesinden bu yana, yöntem genişletilmiştir. Örneğin, yöntemin kemik iliği ile zenginleştirilmiş c-Kit ve negatif yüzey yüklü plakalarla çalıştığı gösterilmiştir14. Transdüksiyon ve elektroporasyon ile uyumluluğu da gösterilm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Akış sitometrisine erişim için WIMM Akış Sitometri Çekirdeğine ve lentiviral vektör üretimi için WIMM Virüs Tarama Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma Kay Kendall Lösemi Fonu ve İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Referências
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
