Isolering av kärnor från flashfrusen levervävnad för encells multiomik

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera kärnor från blixtfrysta, arkiverade levervävnader för enkärniga RNA-seq, ATAC-seq och ledmultiomik (RNA-seq och ATAC-seq).

Abstract

Levern är en komplex och heterogen vävnad som ansvarar för att utföra många kritiska fysiologiska funktioner, såsom upprätthållande av energihomeostas och metabolism av xenobiotika, bland andra. Dessa uppgifter utförs genom tät samordning mellan leverparenkymala och icke-parenkymala celler. Dessutom är olika metaboliska aktiviteter begränsade till specifika områden i leverlobule-ett fenomen som kallas leverzonering. De senaste framstegen inom encellssekvenseringsteknik har gjort det möjligt för forskare att undersöka vävnadsheterogenitet vid en encellsupplösning. I många komplexa vävnader, inklusive levern, kan hårda enzymatiska och / eller mekaniska dissociationsprotokoll negativt påverka livskraften eller kvaliteten på de encelliga suspensioner som behövs för att fullständigt karakterisera detta organ i hälsa och sjukdom.

Detta dokument beskriver ett robust och reproducerbart protokoll för att isolera kärnor från frysta, arkiverade levervävnader. Denna metod ger högkvalitativa kärnor som är kompatibla med nedströms, encelliga omics-metoder, inklusive RNA-seq med en kärna, analys för transposastillgängligt kromatin med högkapacitetssekvensering (ATAC-seq), samt multimodal omik (gemensam RNA-seq och ATAC-seq). Denna metod har framgångsrikt använts för isolering av kärnor från friska och sjuka mänskliga, mus- och icke-mänskliga primatfrysta leverprover. Detta tillvägagångssätt möjliggör opartisk isolering av alla större celltyper i levern och erbjuder därför en robust metod för att studera levern vid encellsupplösningen.

Introduction

Encellsgenomik håller snabbt på att bli en viktig metod för att studera leverfunktion och bedöma effekterna av cellulär heterogenitet vid hälso- och sjukdomstillstånd¹. Den snabba utvecklingen av “multiomik” för samtidig mätning av olika informationslager och den parallella expansionen av robusta beräkningsledningar banar väg för upptäckten av tidigare okända celltyper och subtyper i den normala och sjuka levern².

Möjligheten att utforska biobanker och arkiverade frysta prover har avsevärt ökat möjligheterna att återbesöka och upptäcka rollen av icke-parenkymala celler ^3,4,5 och undersöka rollen av polyploida hepatocyter under åldrande och vid kroniska sjukdomar 6,7,8,9 . Därför beskriver detta dokument ett robust och reproducerbart isoleringsprotokoll med en kärna för flash-frozen (FF) arkiverade lever som är kompatibelt med nedströms enkärnig RNA-sekvensering och ATAC-sekvensering, samt med multimodal omics (gemensam RNA-seq och ATAC-seq) (Figur 1).

Detta arbetsflöde möjliggör undersökning av transkriptomet och kromatintillgängligheten för alla celltyper i levern, oberoende av cellstorlek eller bräcklighet, i enzymatiska dissociationsprotokoll. Det kan utföras med små vävnadssektioner (15-30 mg eller 5-10 mm³) från värdefulla mänskliga prover eller transgena möss. Bestämning av kärnisoleringens höga renhet innefattar kvantifiering och mätning av kärnstorleken, vilket kan korrelera med ökad cellstorlek och åldrande 10,11, och denna renhet är relevant för analysen av både hepatocytploidi¹² och cellstorleksberoende transkriptionsmekanismer ^11,13,14,15 . Dessutom behåller kärnor isolerade från frysta lever värdefull information om leverzonering. Arbetsflödet och vävnadsinsamlingen möjliggör validering av encellsgenomikdata eller ytterligare kompletterande analyser, såsom immunohistokemi eller rumslig transkriptomik från samma vävnad och samma individ. Därför kan detta tillvägagångssätt tillämpas på flera leversjukdomstillstånd och modellorganismer systematiskt och tillförlitligt.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med tysk djurskyddslagstiftning och bestämmelserna från regeringen i Oberbayern. Djurstall godkändes enligt § 11 i den tyska djurskyddslagen och utfördes i enlighet med direktiv 2010/63/EU. 1. Vävnadsberedning Offra en 3 månader gammal till 22 månader gammal manlig C57BL / 6J-mus genom cervikal dislokation. Lägg djuret på ett dissekeringsbräda, säkra extremiteterna med stift och desinficera buken med 70% etanol. Utför obduktion enligt rekommendation av Treuting et al.16.Öppna buken upp till bröstkorgen, visualisera levern och använd pincett för att försiktigt ta bort levern utan att genomborra lobulerna. Extrahera den intakta levern genom att hålla membranet med pincett och ta bort anslutningsvävnaden med sax. Tvätta organet i kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS), klappa det torrt på en ren pappershandduk och skär leverlobulerna i flera bitar för olika ändamål: FF för isolering av en kärna och multiomik; paraformaldehydfixerad (10% PFA) för paraffinbäddning; och/eller inbäddad i förening med optimal skärtemperatur (OCT) för ytterligare histologiska analyser (figur 1A). Alikvotera leverbitarna i kryovialer eller 5 ml skruvlocksrör och frys omedelbart i flytande kväve. Förvara de frysta leverproverna vid −80 °C för nedströms multiomikexperiment med en kärna (figur 1B, C).OBS: Den kryokonserverade vävnaden kan förvaras säkert vid −80 °C i flera år och ska alltid transporteras på torris vid −80 °C före användning. 2. Isolering av kärnor Rengöring av bänkskivor och förberedelse av buffertar och förbrukningsvarorRengör arbetsbänkskivorna och pipetterna med 70% etanol och RNase-dekontamineringslösning, eller använd dedikerade RNase-fria bänkskivor och material. Prechill både svängskopan och centrifuger med fast vinkel, 1,5 ml/2 ml rör och flerbrunnsplattor till 4 °C, som beskrivs nedan. Prechill den RNase-fria pincetten för engångsbruk som används för vävnadshantering, en steril skalpell för engångsbruk och en petriskål på torris (−60 °C). Förkyl Dounce-glashomogenisatorn och stötarna på is (4 °C). Placera varje stöt (A och B) i ett 5 ml rör för att undvika direktkontakt med isen och potentiell RNas-kontaminering. Bered en spädningslösning av jodoxanolmedium (IDM) (tabell 1A) och använd den för att göra 50% och 29% utspädningar av 60% jodixanol stamdensitetsgradientmedium (tabell 1B respektive tabell 1C). Prechill alla rör. För varje prov som ska bearbetas, förbered följande rör:Bered tre 1,5 ml låg-DNA-bindningsrör (ett för det filtrerade vävnadshomogenatet, ett andra som innehåller 250 μl av en 50% utspädning av jodoxanollösning och ett tredje för suspensionen av rena kärnor). Bered ett 2 ml rundbottenrör innehållande 500 μl av en 29% utspädning av jodoxanollösning för densitetsgradientseparationen. Förbered ett 15 ml koniskt rör för kärnisoleringsmedium-2 (NIM-2) och homogeniseringsbuffert (HB). Förbered kärnisoleringsmediet-1 (NIM-1) (tabell 1D) och använd det för att göra NIM-2 (tabell 1E) och därefter HB (tabell 1F). Lägg till båda RNAse-hämmarna strax före användning, som beskrivs nedan i protokollet. Bered kärnlagringsbufferten (NSB) enligt beskrivningen i tabell 1G. Tillsätt rekombinant RNAse-hämmare strax före användning. Tillsätt proteinbaserad RNAse-hämmare i NSB före användning för FACS-sortering (valfritt). Förbered en 500 ml bägare med sterilt vatten för att blötlägga Dounce-homogenisatorerna och stötarna efter vävnadshomogeniseringen för optimal rengöring och underhåll av homogenisatorerna. VävnadshomogeniseringSkär en 20-30 mg (eller 5 mm3) vävnadsbit med en förkyld skalpell inuti petriskålen på torris. Överför sedan petriskålen omedelbart till våt is (4 °C). Tillsätt 1 ml HB och hacka vävnaden så mycket som möjligt med den kalla skalpellen så att den lätt kan aspireras med en 1 ml bred öppningspets.OBS: Använd alltid breda öppningsspetsar för alla vävnads-/kärnöverföringar. Som ett alternativ kan 1 ml spetsar skäras med en steril skalpell på ett sterilt plastlock för att generera breda öppningar (figur 2A). Samla vävnadssuspensionen och överför den till en prekyld 2 ml glas Dounce-homogenisator (figur 2B). Tvätta petriskålen med ytterligare 0,5-1 ml HB och samla alla återstående vävnadsbitar medan du håller allt på is. Gör långsamt och försiktigt fem slag med lös stöt A på is. Undvik att skapa bubblor genom att använda vridande rörelser på stöten när du drar den upp och ner. Se till att stöten rör sig försiktigt från toppen till botten av homogenisatorn med varje slag. Därefter utför 10-15 långsamma slag med tät stöt B på is. Undvik att skapa bubblor.OBS: Det rekommenderas att visuellt inspektera kärnorna under mikroskopet efter 10 slag med stöt B för att fastställa om fler slag behövs. Gör detta genom att använda trypanblå färgning (1: 1-förhållande mellan trypan och prov) och en manuell hemocytometer (t.ex. blanda 10 μL trypanblå med 10 μL kärnsuspension och använd 10 μL av blandningen för undersökning under mikroskopet; Figur 2C). Filtrera homogenatet genom en 50 μm cellsil medan du överför det till ett förkylt 1,5 ml rör. Använd mer än ett filter och/eller rör för homogenater som innehåller en stor mängd bindvävsklumpar. Skölj homogenisatorn och filtren som används med ytterligare 0,5-1 ml HB för att noggrant samla upp allt vävnadshomogenat. Fortsätt till densitetsgradientcentrifugeringen. DensitetsgradientcentrifugeringCentrifugera det filtrerade homogenatet i en förkyld centrifug med fast vinkel vid 1 000 × g i 8 minuter vid 4 °C. Medan provet snurrar, förbered ett 1,5 ml rör innehållande 250 μl 50% jodoxanolutspädning och ett 2 ml rör innehållande 500 μl 29% jodoxanolutspädning. Håll båda rören på is. Efter centrifugering, aspirera supernatanten utan att störa pelleten med hjälp av en vakuumpump.OBS: Användning av manuell pipettering kommer att äventyra kvaliteten på den slutliga kärnupphängningen. Tillsätt 250 μl HB till pelleten med pipettspetsen på 1 ml bred öppning och återsuspendera mycket långsamt. Överför 250 μl av kärnsuspensionen till ett förkylt 1,5 ml rör innehållande 250 μl 50 % jodoxanolutspädning och blanda försiktigt men noggrant för att generera en 25% jodoxanol/kärnsuspension. Överför 500 μl av 25 % jodixanol/kärnsuspensionen till ett förkylt 2 ml rör innehållande 500 μl 29 % jodoxanolutspädning.OBS: 500 μl av 25% jodixanol / kärnsuspensionen bör deponeras försiktigt ovanpå 500 μl 29% jodoxanollösning så att 25% / 29% jodoxanolblandningarna visar tydlig fasseparation. Använd sidan av rörväggen med pipettspetsen placerad i 45 ° vinkel för att skapa detta gradientgränssnitt. Från och med då måste röret hanteras försiktigt för att inte störa denna lutning. Centrifugera röret i en förkyld svängskopcentrifug på 12 500 g i 20 minuter med bromsen inställd på OFF. Strax innan centrifugeringssteget är klart, lägg till RNAse-hämmarna i NSB-bufferten när du fortsätter till scRNA-seq-rörledningarna (se tabell 1G). Efter centrifugering, aspirera supernatanten utan att störa pelleten med hjälp av en vakuumpump.OBS: Användning av manuell pipettering kommer att äventyra kvaliteten på den slutliga kärnupphängningen. Använd 1 ml bredöppningpipettspetsen, återsuspendera försiktigt pelleten i 100-300 μL NSB och överför kärnsuspensionen till ett rent, förkylt 1,5 ml rör. Räkna kärnorna med trypanblå lösning (förhållandet 1:1 mellan trypan och prov) och en manuell hemocytometer (t.ex. blanda 10 μL trypanblått med 10 μl kärnsuspension, och använd 10 μl av blandningen för att räkna; Figur 2D). Använd den erhållna kärnsuspensionen omedelbart för enkärnans genomikanalys.OBS: Kärnsuspensionen i NSB kan förvaras kyld vid 4 °C i upp till 1 vecka för vidare analys med flödes- och/eller bildflödescytometri men inte för snRNA-seq eller snATAC-seq. 3. Kärnsortering för hepatocytploidyprofilering eller välbaserade sekvenseringsmetoder För flödescytometribaserad cellsortering, filtrera kärnsuspensionen genom ett 50 μm-filter till ett förkylt 5 ml FACS-rör. Använd en flödescytometrisorterare utrustad med ett munstycke på 100 μm. Ladda FACS-röret på sorteraren och förhandsgranska provet. Ställ in grindstrategin för kärnsorteringen, börja med en spridningsport genom att plotta det främre spridningsområdet kontra sidospridningsområdet (FSC-A / SSC-A), FÖLJT AV Hoechst-Höjd kontra Hoechst-Area (kärnport) och sedan Hoechst-Bredd kontra Hoechst-Area (singlets grind). Visualisera kärnans ploidiprofil på Hoechst-områdets histogram.OBS: För bättre toppupplösning, visualisera Hoechst-kanalen (450/50) på linjär skala (figur 3A). För sortering i 96-/384-brunnsplattor, ställ in droppfördröjningen och optimera plattjusteringen med hjälp av kolorimetrisk metod med bensidinsubstrat-pepparrotsperoxidas (TMB-HRP), som beskrivits tidigare6. Ställ in både provkylningen och platthållaren så att den kyls vid 4 °C, med provrotationen påslagen vid 300 varv/min. Sortera de enskilda kärnorna i en provkoncentration på ~ 1 x 105 kärnor / ml och med flödeshastigheten vid 200-500 händelser / s. 4. Okulär besiktning och kvantifiering av kärnparametrar genom avbildningscytometri (frivillig) Ladda ett 0,5 ml rör innehållande 50 μl kärnsuspensionen i en koncentration av 2 × 107 kärnor/ml. Ställ in en grind för alla händelser baserat på bildförhållandet jämfört med Hoechst-fluorescenskanalen för att visualisera kärnans ploidiprofil (figur 3B). Skaffa provet med en 40x förstoring med hjälp av brightfield (BF) och Hoechst fluorescenskanalen. Inspektera och kvantifiera 2n- och 4n-kärnor med hjälp av ljusfältsmätningen och Hoechst-fluorescensintensiteten med bildcytometriprogramvara (figur 3C). 5. Enkärnig RNA-seq, ATAC-seq eller multiome bibliotekskonstruktion och sekvensering För droppbaserade snRNA-seq-metoder, ladda den renade kärnsuspensionen direkt i den mikrofluidiska anordningen för automatiserad parallell partitionering och molekylär streckkodning17. När mikrofluidikkörningen är klar i encellspartitioneringsanordningen, samla upp de gelpärlinkapslade kärnorna, inkubera och rengör enligt beskrivningen tidigare i tillverkarens riktlinjer17. Utför 11 polymeraskedjereaktionscykler (PCR) för cDNA-förförstärkningen med hjälp av följande program: 3 min vid 98 °C, (15 s vid 98 °C, 20 s vid 63 °C och 1 min vid 72 °C) x 11, 1 min vid 72 °C och håll vid 4 °C. Fortsätt med en slutreparation och A-tailing-steg och adapterligering, enligt tillverkarens anvisningar17. För den efterföljande slutliga genuttrycksbibliotekskonstruktionen, utför 10 PCR-cykler med följande program: 45 s vid 98 °C, (20 s vid 98 °C, 30 s vid 54 °C, 20 s vid 72 °C) x 10, 1 min vid 72 °C och håll vid 4 °C. Sekvensera de erhållna biblioteken till ett läsdjup på ~ 20 000-50 000 genomsnittliga läsningar per kärna. För den gemensamma multiomiken (RNA + ATAC) droppbaserad sekvensering, inkubera leverkärnorna i lysbuffert i 5 minuter och sedan tagga dem i 1 timme, som beskrivits tidigare18. Ladda de taggade kärnorna direkt i en mikrofluidisk enhet för automatiserad parallellpartitionering och molekylär streckkodning. När mikrofluidikkörningen är klar, samla de gelpärlinkapslade kärnorna, inkubera och rengör enligt tillverkarens beskrivning18. Utför sex PCR-cykler för cDNA-förförstärkningssteget med hjälp av följande program: 5 min vid 72 °C, 3 min vid 98 °C, (20 s vid 98 °C, 30 s vid 63 °C, 1 min vid 72 °C) x 6, 1 min vid 72 °C och håll vid 4 °C. Ta 35 μl av det förförstärkta provet och utför en cDNA-amplifiering enligt följande: 3 min vid 98 °C, (15 s vid 98 °C, 20 s vid 63 °C, 1 min vid 72 °C) x 6, 1 min vid 72 °C och håll vid 4 °C. Fortsätt med slutreparationen och A-tailingsteget och adapterligeringen, som anges av tillverkaren18 . För den efterföljande slutliga provindexerings-PCR, utför 15 PCR-cykler enligt följande: 45 s vid 98 °C, (20 s vid 98 °C, 30 s vid 54 °C, 20 s vid 72 °C) x 15, 1 min vid 72 °C och håll vid 4 °C. För konstruktion av ATAC-bibliotek, använd 40 μL och förstärk för sex PCR-cykler för provindexering med följande program: 45 s vid 98 °C, (20 s vid 98 °C, 30 s vid 67 °C, 20 s vid 72 °C) x 6, 1 min vid 72 °C och håll vid 4 °C. Sekvensera de erhållna multiomgenuttrycksbiblioteken till ett minsta läsdjup på 20 000 läspar per kärna och multioma ATAC-biblioteken till ett minsta läsdjup på 25 000 läspar per cell, enligt tillverkarens rekommendationer18.

Representative Results

Detta arbetsflöde för isolering av en kärna från frysta leverprover är skräddarsytt för enkärnig multiomik och bygger på tre huvudsteg, som kan sammanfattas som i) provsamling för parallell analys av cellulär heterogenitet och vävnadsarkitektur, ii) enkärnig suspension och iii) multiomik med en kärna (figur 1 ). De extraherade leverarna dissekeras från avlivade möss och skärs i bitar för histologisk inspektion för antingen paraffininbäddning, kryosektion eller båda. Andra skurna bitar är omedelbart blixtfrysta i flytande kväve för nedströms, enkärnig isolering för multiomikanalyser. Detta system för vävnadsinsamling gör det möjligt för användaren att ytterligare validera enkärniga omics-data om vävnadssektioner från samma individ och därigenom komplettera datauppsättningen med rumslig transkriptomik eller med immunohistokemiska analyser, om det behövs. Den mikroskopiska undersökningen av kärnorna extraherade från frysta lever med den metod som beskrivs här visar att densitetsgradientcentrifugeringssteget i hög grad underlättar avlägsnandet av oönskade cell- och vävnadsskräp (figur 2C,D). Dessutom bevarar denna metod alla nivåer av ploiditet, som kan valideras och kvantifieras genom cytometriska analyser (figur 3). För att ytterligare validera prestandan för detta protokoll genomförde vi droppbaserade snRNA-seq på osorterade och FACS-sorterade kärnor och analyserade data efter Seurat-rörledningen. I korthet framställdes de extraherade enskilda kärnorna för droppbaserad snRNA-seq som beskrivits tidigare19. För snRNA-seq av 2n- och 4n-kärnor eller högre nivåer av ploidi användes 11 cykler för cDNA-förstärkningssteget och 10 cykler för den slutliga genuttrycksbibliotekskonstruktionen. De resulterande biblioteken sekvenserades till ett läsdjup på ~ 25 000-39 000 genomsnittliga läsningar per kärna. De erhållna enkärnläsningarna mappades till GRCm39 / mm39-musgenomet. När förbehandlingspipelinen kördes lades kommandot — include-intron till för att fastställa inkluderingen och kvantifieringen av det oskarvade budbärar-RNA (mRNA) som finns i kärnorna. EmptyDrops-algoritmen som ingår i justeraren filtrerades bort och tog bort de tomma dropparna. R-paketet Seurat (version 4.1.1) användes för att beräkna QC-mått (Quality Control) med hjälp av UMI-matrisen (Unique Molecular Identifier) som matas ut av snRNA-seq-analyspipelinen. Räkningar med mindre än 100 funktioner (gener) och mindre än 10 celler togs bort. Kärnorna filtrerades enligt identifierade QC-trösklar: minsta antal gener = 200 och maximalt antal gener = 8 000, mitokondriell fraktion <1% och ribosomal fraktion <2%. De 3 000 bästa högvariabla generna (HVG) användes för huvudkomponentanalysen (PCA), som implementerades i Seurat. Grafbaserad klustring utfördes efter inmatning av de 15 bästa PC-dimensionerna som härrör från PCA-analysen. För att gruppera cellerna använde vi modularitetsoptimeringstekniken (Louvain-algoritmen) med en upplösningsparameter inställd på 0,5. För att visualisera och utforska denna datauppsättning körde vi icke-linjär dimensionell reduktion, nämligen Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Identiteten för varje kluster tilldelades baserat på förkunskaper om markörgenerna 6,20,21. Figur 4A visar högkvalitativa mätvärden från de data som erhållits med hjälp av denna metod för kärnextraktion. UMAP representerar antalet räkningar över alla kärnor och de viktigaste celltyperna som med säkerhet kan identifieras endast med kärntranskriptomet och relativt grund sekvensering (~ 25 000-40 000 medelläsningar per cell) (Figur 4B). Detta tillvägagångssätt möjliggör undersökning av leverspecifika transkriptionsfaktorer som Hnf4a, Mlxipl och Ppara, liksom nedströms målgener som är involverade i metabolismen av xenobiotika (dvs. Cyp2e1 och Cyp2f2) (Figur 4C). Observera att de extraherade kärnorna behöll kritisk information om leverzonering, vilket framgår av det komplementära mönstret av kännetecknande gener såsom pericentral Cyp2e1 och periportal Cyp2f2 (Figur 4C). Vi bedömde vidare kompatibiliteten hos de osorterade kärnorna som extraherats med denna metod med nyare multiomicsanalyser för samtidig profilering av det epigenomiska landskapet (ATAC) och genuttryck (RNA) i samma enskilda kärnor18. Vi optimerade kärnlysinkubationstiden till 5 minuter före införlivandet. Sekvenseringsbiblioteken konstruerades genom att köra sex PCR-cykler för cDNA-förförstärkningen. Från det förförstärkta provet togs 35 μL och förstärktes ytterligare med 15 PCR-cykler för provindexering för att konstruera genuttrycksbiblioteket. Ett representativt elektroferogram av cDNA-spåret visas i figur 5A (överst). För konstruktionen av ATAC-biblioteken användes 40 μL förförstärkt prov och kördes i ytterligare sex PCR-cykler för provindexering, med det representativa elektroferogrammet för DNA-spåret som visas i figur 5A (botten). Det resulterande genuttrycksbiblioteket (RNA) sekvenserades till ett djup av 44 600 läsningar per kärna och ATAC-biblioteket till ett djup av 43 500 läsningar per kärna (figur 5B). I likhet med det ovan beskrivna utfördes enkelmodalitet, droppbaserat sekvenseringsprotokoll, läsmappning, justering, borttagning av tomma droppar och fragmenträkning enligt standardriktlinjer, som beskrivits tidigare, med hjälp av GRCm39 / mm39-referensgenomet18. Med hjälp av Seurat- och Signac-paketen22 utförde vi en “viktad närmaste granne” (WNN) -analys för flera mätningar av båda metoderna (RNA + ATAC) (figur 5C), vilket gjorde det möjligt för oss att identifiera och kommentera både de större och mindre levercellstyperna utan framträdande fördomar på grund av cellstorlek eller nukleär bräcklighet (figur 5D). Rörledningen, som publicerats av Satija-laboratoriet22,23, inkluderar standard QC-stegförbehandling och dimensionell reduktion som görs på båda analyserna oberoende av varandra. För att få en bra representation av den viktade kombinationen av RNA-seq- och ATAC-seq-modaliteterna plottades WNN-grafen och användes för UMAP-visualisering, klustring och annotering baserat på tidigare identifierade markörgener 6,20,21. I likhet med analyserna med enkel modalitet upptäckte vi också uppströms transkriptionsregulatorer (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) och kännetecknande gener för leverzonering (Hamp, Cyp2e1 och Cyp2f2) (Figur 5E). Figur 1: Experimentell översikt, arbetsflöde och encellsgenomiska applikationer. (A) Illustrativ representation av vävnadsprovtagning för histologi (vänster, tre sektioner väljs för paraffinbäddning och / eller kryosektion), blixtfrusen vävnadssamling för encellsgenomik (mitten) och representativa immunohistokemi- och immunofluorescensanalyser (höger); skalstång = 100 μm. (B) Kritiska steg för högkvalitativa enkärniga suspensioner. (C) Kärnsuspensionerna kan laddas på ett 10x kromchip eller användas för FACS-sortering och plattbaserade metoder. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Leverdissektion och vävnadshomogenisering av dounce-glasvävnad. (A) Representativ murin lever från en 3 månader gammal C57BL6 / J mus (vänster); leversektionen som används för isoleringar med en kärna före (mitten) och efter att vävnaden har malts med skalpellen (höger). Skalstänger = 1 cm. (B) Illustrativa bilder av 2 ml Dounce-glashomogenisering före slag med “lös” stöt A (vänster) och efter “tät” stöt B (höger). Övervakning av vävnadshomogeniseringen med hjälp av en hemocytometer (C) före gradientcentrifugering och (D) efter gradientcentrifugering. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Fluorescensaktiverad cellsortering och avbildningsflödescytometri för karakterisering av kärnor med hög genomströmning . (A) Gating-strategi för FACS-sortering med en kärna i en platta för förhör av olika nivåer av ploididy. Scatter gate baserat på det främre spridningsområdet kontra sidospridningsområdet som är inställt på att utesluta skräp; kärnport baserad på Hoechst-höjd kontra Hoechst-område som innehåller flera kärnpopulationer; singlets gate baserad på Hoechst-Width kontra Hoechst-A set för dubblerad diskriminering; Hoechst-A-histogrammet möjliggör visualisering av kärnans ploidiprofil. (B) Representativ kvantifiering av avbildningscytometri av alla händelser (vänster) och enstaka (höger) händelser, som visar diploida och tetraploida kärnor. (C) Brightfield- och Hoechst-bilder av 2n- och 4n-kärnor och deras kvantifiering med hjälp av bildcytometri. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; FSC-A = spridningsområde framåt; SSC-A = sidospridningsområde; Hoechst-H = Hoechst-höjd; Hoechst-A = Hoechst-området; Hoechst-W = Hoechst-bredd. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Djup karakterisering av hepatocytploidi med snRNA-seq . (A) Fioldiagram som visar antalet gener, räkningar, procentandel mitokondriella gener och procentandel ribosomala gener som detekterats. B) UMAP som visar de celltyper som påvisats med snRNA-seq (vänster), med kvantifieringen uttryckt i procent kärnor (höger). (C) UMAP illustrerar antalet räkningar och anger uttrycket av hepatocytspecifika gener. Alla kärnor (övre raden), 2n kärnor (mellersta raden) och 4n kärnor (nedre raden). Förkortningar: snRNA-seq = enkärnig RNA-seq; UMAP = enhetlig grenrörs approximation och projektion; Mitoc. = mitokondriella gener; Ribos. = ribosomala gener. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Kvalitetskontroll och analys av multiomik (gemensam RNA-seq och ATAC-seq) från frysta, arkiverade unga lever . (A) Representativa automatiska elektroforetiska spår erhållna efter den multiomiska rörledningen som visar molekylviktsprodukten efter cDNA-syntes och ATAC. (B) Fioldiagram som visar antalet räkningar för ATAC-seq, RNA-seq, procentandelen mitokondriella gener och procentandelen ribosomala gener före och efter filtrering. (C) UMAP visar genuttrycket från RNA-seq (vänster), ATAC-seq (mitten) och gemensamma modaliteter-RNA-seq och ATAC-seq (höger). (D) Olika celltyper kommenteras i olika färger, med uttryck av indikerade hepatocytspecifika gener. (E) Funktionsdiagram som visar det klusterspecifika uttrycket av de angivna generna i de angivna celltyperna. Förkortningar: ATAC-seq = analys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning; Mid Hep = mellersta zonala hepatocyter; Endo = endotelceller; PV Hep = periportal hepatocyter; Icke-z Hep = icke-zonerade hepatocyter; CV Hep = pericentrala hepatocyter; Kup & DC = Kupffer & dendritiska celler; SC = stellatceller, Neu = neutrofiler; Chol = kolangiocyter; Mitoc. = mitokondriella gener; Ribos. = ribosomala gener. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Reagens Lager 10 ml 15 ml 50 ml a ) Iodixanolmedium (IDM) 250 mM Sackaros 1M 12,5 ml 150 mM KCl 2M 3,75 ml 30 mM MgCl2 1M 1,5 ml 60 mM Tris buffert pH 8,0 1M 3 ml Ultrarent RNasfritt vatten 29,25 ml B) 50 % IDM Jodoxanol 60% 12,5 ml IDM 2,5 ml (C) 29 % IDM Jodoxanol 60% 7,25 ml IDM 7,75 ml (D ) Kärnisolering medium-1 (NIM-1) 250 mM Sackaros 1M 12,5 ml 25 mM KCl 2M 0,625 ml 5 mM MgCl2 1M 0,25 ml 10 mM Tris buffert pH 8,0 1M 0,5 ml Ultrarent Rnase-fritt vatten 36.125 ml (E ) Kärnisolering medium-2 (NIM-2) NIM-1-buffert 9,99 ml Ditiotreitol (DTT) 1 mM 0,01 ml Proteashämmare tablett (EDTA-fri) 1 1 tablett f ) Homogeniseringsbuffert (HB) NIM-2-buffert 9.697 ml Rekombinant RNas-hämmare 40 U/μL 0,1 ml Proteinbaserad RNAse-hämmare (SUPERase•IN) 20 U/μL 0,1 ml 0,1% Triton-X 10% 0,1 ml 3 μg/ml Hoechst 33342 10 mg/ml 0,003 ml (G ) Buffert för kärnlagring (NSB) 166,5 mM Sackaros 1M 1.665 ml 5 mM MgCl2 1M 0,05 ml 10 mM Tris pH 8,0 1M 0,1 ml Rekombinant RNas-hämmare 40 U/μL 0,1 ml Proteinbaserad RNas-hämmare (SUPERase•IN) * 20 U/μL 0,1 ml Ultrarent RNasfritt vatten 8.085 ml * Valfritt (endast för FACS-sortering) Tabell 1: Lösningsrecept. A) Beredning av jodoxanolmedium (IDM). B) 50 % utspädning av jodoxanollösning. C) 29 % utspädning av jodoxanollösning. (D) Beredning av kärnor isolering medium-1 (NIM-1). (E) Beredning av kärnor isolering medium-2 (NIM-2). F) Beredning av homogeniseringsbuffert (HB). (G) Beredning av kärnlagringsbuffert (NSB).

Discussion

Dissekering av leverns cellulära sammansättning med encellig eller enkärnig RNA-seq ger en djupare förståelse för leversjukdomsutveckling och progression 3,4,5,24. Encellsisolering från lever är tidskrävande och kräver protokoll som involverar hård mekanisk eller enzymatisk dissociation^25,26,27. Det är allmänt accepterat att varje vävnad kräver en systematisk utvärdering för att bestämma det optimala vävnadsdissociationsprotokollet, liksom en lämplig lagringsmetod för att fånga bräckliga celltyper eller kärnor²⁸. Beroende på vävnadstillgänglighet, sjukdom av intresse, utvecklingsstadium eller modellorganism kan beredningen av en enkärnig suspension för nedströms bearbetning vara en lämpligare metod än att använda encellssuspensioner. Viktigt är att scRNA-seq och snRNA-seq i levern har visat en hög korrelation mellan nukleärt och cytoplasmatiskt mRNA, vilket tyder på att båda metoderna presenterar kompletterande information 2,3,4,6,29.

Detta dokument ger en standardiserad, robust och reproducerbar isolering med en kärna från frysta, arkiverade leverprover från möss och andra arter, inklusive människor och makaker. Denna metod kan användas för vildtypsmöss som matas med chow och en fettrik diet (HFD) och för musmodeller av leverfibros med både väl plattbaserade och droppbaserade enkärniga genomiska metoder⁶. Denna metod bygger på det protokoll som ursprungligen beskrevs för hjärnvävnad av Krishnaswami et ^al.30 med ytterligare modifieringar skräddarsydda för blixtfrusen lever. Optimal homogenisering frigör de flesta kärnorna från vävnaden utan att negativt påverka kärnmembranets integritet. Överdouncing kan dock skada de bräckliga kärnorna och minska deras övergripande kvalitet. Unga och / eller feta lever kräver vanligtvis bara 5 slag med stöt A och 10 slag med stöt B, medan gamla och / eller fibrotiska lever kan kräva 15 slag med stöt B men inte mer. Det rekommenderas därför inte att utföra fler slag utöver de siffror som anges här. Överdouncing kan påverka kvaliteten på enkärnssuspensionen negativt och öka mängden omgivande RNA. Därefter kan detta leda till behovet av att utföra ytterligare beräkningsfiltreringssteg under dataanalyserna nedströms.

Protokollet som presenteras här är mångsidigt och kan anpassas till olika leverförhållanden hos unga (3 månader) och gamla (24 månader) möss. Eftersom vi fann att en större del av levern är nödvändig för gamla, HFD och fibrotiska vävnader, kan storleken på vävnaden som är tillgänglig för bearbetning utgöra en begränsning för vissa användare med mindre mängder utgångsbiologiskt material. Gradientrening rekommenderas dock starkt för omedelbar provbehandling med droppbaserade genomiska analyser. Om kärnorna behöver FACS sorteras i 96-/384-brunnsplattor för välbaserade analyser kan gradientrening utelämnas. Vi uppmuntrar fortfarande användare att utföra gradientrening om det finns tillräckligt med vävnadsprov för att få den rekommenderade kärnkoncentrationen för FACS-sortering (dvs. ~ 1 × 10⁵ kärnor / ml).

Levern kännetecknas av hepatocyternas polyploida natur⁹, men hepatocytploidens roll i normal fysiologi och sjukdom är ännu inte klar. Det finns en växande mängd bevis som tyder på att ploidi ger genomisk variation³¹, och det är välkänt att ploidy ökar med^32,33 års ålder. Anrikningen av mononukleerade tetraploida hepatocyter är emellertid också kliniskt associerad med dålig prognos vid humant hepatocellulärt karcinom (HCC)³⁴. På samma sätt är förändringar i hepatocytploidinivåer kopplade till åldranderelaterade kroniska leversjukdomar såsom alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD)^35,36,37. Ploidy är villkoret att ha mer än två kopior av genomet, vilket kan utforskas genom att färga genominnehållet med ett DNA-färgämne som Hoechst³⁸. Hoechst-färgämnet, som tillsätts till HB före extraktion, märker alla kärnor under isoleringsprotokollet. Detta möjliggör skillnaden mellan diploida och polyploida kärnor baserat på deras DNA-innehåll när de exciteras av en UV (350 nm) eller violett (450 nm) laser på ett flödescytometriinstrument. Med den visade gatingstrategin kan 2n, 4n, 8n och högre nivåer av hepatocytploidi undersökas i frysta, arkiverade lever för att bättre förstå rollen av cellulär heterogenitet i vävnadsfunktion¹ (Figur 3A). Vidare kan kärnmorfologin, inklusive storlek och volym, kvantifieras med hjälp av avbildningsflödescytometri för att korrelera förändringar i kärnstorleken med förändringar i det totala antalet räkningar eller antal gener beroende på ploidinivån (figur 3B, C).

Multimodal omics-mätning ger möjlighet att undersöka flera lager av genomisk organisation samtidigt. Den gemensamma RNA + ATAC-multiomikmetoden möjliggör undersökning av uppströmsregulatorer och nedströms metaboliska gener, vilket ger ett omfattande tillvägagångssätt för att studera transkriptionella nätverk och kromatinarkitekturen associerad med leverfunktion vid encellsupplösningen. Dessutom, med framstegen inom beräkningsmetoder som kan ta hänsyn till datasparsitet och minskningen av sekvenseringskostnader, är encells multiomik banbrytande för bedömningen av flera modaliteter från samma cell. Detta isoleringsprotokoll med en kärna är kompatibelt med den individuella och gemensamma bedömningen av uttrycks- och kromatindatauppsättningar. Vi har använt standardledningar som fastställts av Stuart et al.23 (Signac-paketet) för att illustrera kvaliteten på data, medan flera tillgängliga och alternativa beräkningsmetoder enkelt kan antas för nedströmsanalyser^23,39,40,41.

Sammantaget möjliggör multiomik med en kärna undersökning av bioarkiverade, FF-mus-, mänskliga och icke-mänskliga primatlevervävnader med hjälp av en mycket liten mängd utgångsprovmaterial genom att implementera kärnextraktionsprotokollet som presenteras här. Detta ovärderliga verktyg kommer att ge leverbiologer möjlighet att förhöra både genuttryck och kromatintillgänglighet i samband med olika leverpatologier. Dessutom kan olika nivåer av hepatocytploidi och den resulterande justeringen av genuttryck beroende på deras plats i leverlobule avslöja deras roll i leverpatologier. Därför förväntar vi oss att undersökningen av cellulär heterogenitet kommer att ge nya möjligheter för utveckling av precisionsmedicin och riktade interventioner mot sjukdomar som HCC och NAFLD.

Materials

10% Tween 20 – 5 mL	Bio-Rad	1662404
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Adhesive PCR film	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1851196
Cell Sorter			For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000619	Use chilled at 4 °C
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions	10X Genomics	1000269
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions	10X Genomics	1000285
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	11873580001
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution	Sigma Aldrich	646563	Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration.
DNA AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	10223471	Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	16628742
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	16638742
Elution Buffer (EB) – 250 mL	Qiagen	19086
Eppendorf ThermoMixer C	Thermo Fisher Scientific	13527550
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock	Thermo Fisher Scientific	13518470
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL	Thermo Fisher Scientific	10517694
Filters 50 µm, sterile	SYSMEX PARTEC – CELLTRICS	04-004-2327	Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L	Ricca Chemical Company	3290-32
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3905
Herenz Heinz ABS Forceps	Thermo Fisher Scientific	1131884
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water	Invitrogen	H3570	Light-sensitive
Imaging Flow Cytometer			For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream
Invitrogen TE Buffer – 100 mL	Thermo Fisher Scientific	11568846
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
MgCl2 (1 M), 100 mL	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips	Thermo Fisher Scientific	10209104
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips	Thermo Fisher Scientific	10733087
Mörser 2 mL DOUNCE	Wagner & Munz GmbH	9651632	RNase zap and rinse with MillQ before use
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012	Benchmark Scientific	C1012	Or any other strip and tube mini centrifuge
Neubauer Hemocytometer	OMNILAB  LABORZENTRUM	5435293	Visualize and count nuclei under microscope
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9937
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma Aldrich	D1556
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O	Mettler Toledo	30389218
Pistill "A" 2 mL	Wagner & Munz GmbH	9651621	RNase zap and rinse with MillQ before use
Pistill "B" 2 mL	Wagner & Munz GmbH	9651627	RNase zap and rinse with MillQ before use
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube	Thermo Fisher Scientific	10579691
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	10634141
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes	Thermo Fisher Scientific	10100151
Protector RNase inhibitor – 2,000 U	Sigma Aldrich	3335399001	Keep in -20 °C until use
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Keep in -20 °C until use
Recombinant RNase Inhibitor	Clontech Takara	2313B	Keep in -20 °C until use
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific	AM12450
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780	Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
SPRIselect – 60 mL	Beckman Coulter	B23318	Aliquot and store in 4 °C
Sucrose, 500 g	Sigma Aldrich	S0389-500G	Make a 1 M stock solution
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels	Thermo Fisher Scientific	11798343
Tris-HCI (1M), pH 8.0	Invitrogen	15568025
Triton X-100, 98%, 100 mL	Thermo Fisher Scientific	10671652	Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light.
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	11538886
Vortex- Mixer	VWR	444-1372	Or any other type of vortex