Prüfung der In-vitro- und In-vivo-Effizienz von mRNA-Lipid-Nanopartikeln, die durch mikrofluidisches Mischen formuliert wurden
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Formulierung von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) vorgestellt, die mRNA verkapseln, die für Glühwürmchen-Luziferase kodiert. Diese LNPs wurden in vitro in HepG2-Zellen und in vivo in C57BL/6-Mäusen auf ihre Wirksamkeit getestet.
Abstract
Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben in jüngster Zeit mit der erfolgreichen Entwicklung der COVID-19-mRNA-Impfstoffe von Moderna und Pfizer/BioNTech große Aufmerksamkeit erregt. Diese Impfstoffe haben die Wirksamkeit von mRNA-LNP-Therapeutika nachgewiesen und die Tür für zukünftige klinische Anwendungen geöffnet. In mRNA-LNP-Systemen dienen die LNPs als Verabreichungsplattformen, die die mRNA-Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen schützen und ihre intrazelluläre Verabreichung vermitteln. Die LNPs bestehen in der Regel aus vier Komponenten: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG). Hier werden LNPs, die mRNA verkapseln, die für die Glühwürmchen-Luciferase kodieren, durch mikrofluidisches Mischen der organischen Phase, die LNP-Lipidkomponenten enthält, und der wässrigen Phase, die mRNA enthält, formuliert. Diese mRNA-LNPs werden dann in vitro getestet, um ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen mit einem biolumineszierenden plattenbasierten Assay zu bewerten. Zusätzlich werden mRNA-LNPs in vivo in C57BL /6-Mäusen nach intravenöser Injektion über die laterale Schwanzvene untersucht. Die Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung wird mit einem In-vivo-Bildgebungssystem durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse wurden für die mRNA-LNP-Eigenschaften, ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen und den gesamten lumineszenten Fluss in C57BL/6-Mäusen gezeigt.
Introduction
Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben sich in den letzten Jahren im Bereich der nicht-viralen Gentherapie als vielversprechend erwiesen. Im Jahr 2018 hat die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) das allererste RNA-Interferenz-Therapeutikum (RNAi), Onpattro von Alnylam, zur Behandlung der hereditären Transthyretin-Amyloidosezugelassen 1,2,3,4. Dies war ein wichtiger Schritt vorwärts für Lipid-Nanopartikel und RNA-basierte Therapien. Kürzlich erhielten Moderna und Pfizer/BioNTech FDA-Zulassungen für ihre mRNA-LNP-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 4,5. In jeder dieser LNP-basierten Nukleinsäuretherapien dient das LNP dazu, seine Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen zu schützen und eine starke intrazelluläre Verabreichung zu erleichtern 6,7. Während LNPs in RNAi-Therapien und Impfstoffanwendungen erfolgreich sind, wurden mRNA-LNPs auch für den Einsatz in Proteinersatztherapien8 sowie für die gleichzeitige Verabreichung von Cas9-mRNA und Leit-RNA für die Verabreichung des CRISPR-Cas9-Systems für dieGeneditierung 9 untersucht. Es gibt jedoch nicht die eine spezifische Formulierung, die für alle Anwendungen gut geeignet ist, und subtile Änderungen der LNP-Formulierungsparameter können die Wirksamkeit und Bioverteilung in vivo stark beeinflussen 8,10,11. Daher müssen individuelle mRNA-LNPs entwickelt und evaluiert werden, um die optimale Formulierung für jede LNP-basierte Therapie zu bestimmen.
LNPs werden üblicherweise mit vier Lipidkomponenten formuliert: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG)11,12,13. Die potente intrazelluläre Verabreichung, die durch LNPs ermöglicht wird, beruht zum Teil auf der ionisierbaren Lipidkomponente12. Diese Komponente ist bei physiologischem pH-Wert neutral, wird aber im sauren Milieu des Endosoms11 positiv geladen. Es wird angenommen, dass diese Änderung der Ionenladung einen wichtigen Beitrag zur endosomalen Flucht leistet12,14,15. Zusätzlich zum ionisierbaren Lipid verbessert die Phospholipidkomponente (Helferlipid) die Verkapselung der Fracht und hilft bei der endosomalen Flucht, das Cholesterin bietet Stabilität und verbessert die Membranfusion, und das Lipid-PEG minimiert die LNP-Aggregation und Opsonisierung im Kreislauf10,11,14,16. Um das LNP zu formulieren, werden diese Lipidkomponenten in einer organischen Phase, typischerweise Ethanol, kombiniert und mit einer wässrigen Phase vermischt, die die Nukleinsäurefracht enthält. Das LNP-Formulierungsverfahren ist sehr vielseitig, da es ermöglicht, verschiedene Komponenten leicht zu substituieren und mit unterschiedlichen Molverhältnissen zu kombinieren, um viele LNP-Formulierungen mit einer Vielzahl von physikalisch-chemischen Eigenschaften zu formulieren10,17. Bei der Erforschung dieser großen Vielfalt von LNPs ist es jedoch entscheidend, dass jede Formulierung mit einem standardisierten Verfahren bewertet wird, um die Unterschiede in der Charakterisierung und Leistung genau zu messen.
Hier wird der komplette Workflow für die Formulierung von mRNA-LNPs und die Bewertung ihrer Leistung in Zellen und Tieren skizziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit diesem Arbeitsablauf kann eine Vielzahl von mRNA-LNPs formuliert und auf ihre In-vitro– und In-vivo-Effizienz getestet werden. Ionisierbare Lipide und Hilfsstoffe können ausgetauscht und mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen und unterschiedlichen Gewichten von ionisierbaren Lipiden zu mRNA kombiniert werden, um mRNA-LNPs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften herzustellen22. Hier formulierten wir C12-200 mRNA-LNPs mit einem molaren Verhältnis von…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. bedankt sich für die Unterstützung durch einen New Innovator Award (DP2 TR002776 des Direktors der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH), einen Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), einen CAREER-Preis der US-amerikanischen National Science Foundation (CBET-2145491) und zusätzliche Mittel der National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 und NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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