Este protocolo describe la configuración y el funcionamiento de un sistema de microrrespirometría que puede emplearse para investigar las características fisiológicas del holobionte de coral.
La actividad metabólica, definida como la suma de los procesos del organismo que involucran energía, es de importancia crítica para comprender la función y la evolución de la vida en la Tierra. La medición de las tasas metabólicas de los organismos está, por lo tanto, en el centro de la explicación de los estados fisiológicos de los organismos, sus funciones ecológicas y el impacto del cambio ambiental en las especies dentro de los ecosistemas terrestres y acuáticos. En los arrecifes de coral, se han utilizado medidas del metabolismo para cuantificar el funcionamiento de la simbiosis entre los corales y sus simbiontes de algas obligadas (Symbiodiniaceae), así como para evaluar cómo los factores de estrés ambiental, incluido el cambio climático, afectarán la salud de los corales. A pesar de esta importancia, hay una falta de métodos, y por lo tanto de datos, relacionados con las mediciones de la tasa metabólica en la descendencia de corales, probablemente debido a su pequeño tamaño. Para abordar esta brecha, este estudio tuvo como objetivo desarrollar una configuración personalizada para medir la respiración de ecologías de animales marinos pequeños (rango de tamaño milimétrico). Este bajo costo y fácil configuración debería permitir una mejor medición de la tasa metabólica. Esto será esencial para la investigación ecológica aplicada que utiliza la producción sexual de corales para la restauración de arrecifes.
La respiración es una medida biológica crítica que señala la actividad metabólica general de un organismo, pero al igual que otros rasgos críticos (crecimiento), esdifícil de medir en organismos pequeños. La respiración se puede definir como la oxidación de moléculas orgánicas mediante el uso de oxígeno. Este proceso genera la energía química necesaria para la función celular (es decir, el metabolismo), que es esencial para la supervivencia de los organismos. Alternativamente, el metabolismo anaeróbico da como resultado una deuda de oxígeno2. Las tasas de respiración se pueden determinar utilizando optodos que miden el uso (y, por lo tanto, la disminución) de la concentración de oxígeno a lo largo del tiempo en una cámara cerrada, una práctica generalmente conocida como respirometría. Dado que la mayoría de los organismos no almacenan oxígeno, la tasa de metabolismo se puede inferir a través de la correlación directa entre la respiración y el uso de carbono. Debido a esto, las tasas de respiración se pueden convertir en el uso diario de carbono, que informa funciones metabólicas críticas como el crecimiento, la reproducción y la capacidad de mantener la homeostasis metabólica durante tiempos de estrés ambiental 4,5, incluidas las condiciones de ola de calor que generalmente conducen al estrés o al blanqueamiento de los corales.
Los arrecifes de coral están disminuyendo a un ritmo acelerado en todo el mundo. El animal de coral alberga un consorcio de socios (que incluye dinoflagelados Symbiodiniaceae, hongos, bacterias y virus), conocidos colectivamente como el “holobionte”6. A medida que aumentan las temperaturas de los océanos, los corales y, por lo tanto, los arrecifes de coral, están bajo una presión cada vez mayor para sobrevivir, ya que las altas temperaturas conducen a la pérdida de los dinoflagelados Symbiodiniaceae (en adelante simbiontes), un fenómeno conocido como blanqueamiento7. Muchos nutrientes no están disponibles para los corales en aguas tropicales oligotróficas, incluido el nitrógeno inorgánico y el fósforo8. Para hacer frente a la situación, los corales forman una simbiosis nutricional obligada con sus simbiontes dinoflagelados (Symbiodiniaceae), que proporcionan la mayoría de los nutrientes que necesita el coral huésped para sobrevivir y depositar sus esqueletos de carbonato de calcio9. Una simbiosis funcional puede caracterizarse por altos niveles de intercambio de carbono entre los miembros de la pareja10,11, y la regulación de la simbiosis implica una homeostasis dinámica12.
Durante el estrés térmico, esta regulación dinámica y la comunicación se interrumpen, lo que resulta en disbiosis y blanqueamiento (revisado en la referencia13). Por lo tanto, las mediciones metabólicas, como la fotosíntesis y la respiración, tienen el potencial de dilucidar tanto los estados disbióticos sanos como los no regulados de los corales, y medir con precisión estos procesos a través de la ontogenia es fundamental para comprender el funcionamiento del organismo. Esto es particularmente importante a medida que aumenta la frecuencia y la magnitud de los eventos de blanqueamiento masivo, con el potencial de influir en los cambios en el intercambio de nutrientes de los simbiontes, donde se ha encontrado que la transferencia de carbono disminuye a medidaque aumentan las temperaturas. Esto podría deberse a mecanismos dirigidos por el simbionte que secuestra nutrientes o a compensaciones fisiológicas duras (aumento de la tolerancia térmica pero disminución de la supervivencia del huésped 15,16,17). Las alteraciones en la simbiosis pueden provenir tanto del simbionte como del huésped, aunque un factor principal es probablemente el mal funcionamiento celular del simbionte18. Sin embargo, el estrés causado por el aumento de la temperatura del agua de mar desestabiliza esta simbiosis; El intercambio de carbono del simbionte al huésped disminuye 19,20 y puede sobrevenir la inanición del coral. Esto puede reflejarse en la disminución de las reservas de lípidos y carbohidratos en los corales debido al aumento del uso del huésped (“aumento del catabolismo del carbono fijo”), probablemente debido a la disminución de la participación de los simbiontes11. Junto con la contribución de la fotosíntesis y la respiración de los simbiontes de los corales, la respiración del animal coralino es una medida importante para comprender la salud de los corales, los impactos del blanqueamiento y el intercambio de nutrientes entre estos socios, y el crecimiento del holobionte, un fenotipo relevante para sobrevivir al cambio ambiental 8,21,22. Finalmente, dado que muchos corales son simbióticos, el uso de la respirometría para caracterizar la fotosíntesis además de la respiración es particularmente útil para contextualizar las relaciones P:R y comprender si la simbiosis es estable o no (por ejemplo, referencia23).
Los cambios ambientales, por lo tanto, causan cambios en los presupuestos energéticos del coral y sus simbiontes, lo que lleva a diferencias en el crecimiento14. Para hacer frente a la situación, el coral huésped puede aumentar la respiración y el uso de lípidos para satisfacer sus demandas metabólicas; El estrés térmico puede reducir la productividad neta en un 60% debido a este aumento de la respiración14, medido por un cambio en el oxígeno disuelto. Las simbiodiáceas también pueden aumentar la asimilación de nitrógeno y la retención de carbono14,24, y luego utilizar estas reservas para cambiar la energía hacia sus propios mecanismos de reparación y protección25,26. El equilibrio de N y C es importante para regular el crecimiento, y P en particular27, que puede manifestarse como una regulación dinámica de la abundancia de simbiontes. De hecho, la evidencia recolectada de corales a lo largo de grandes extensiones de arrecifes (>1.000 km) sugiere que los huéspedes tienen la capacidad de limitar el crecimiento de simbiontes a través de la regulación de P, aunque esto varía según la especie de coral27.
En conjunto, estos estudios sugieren una ganancia de tolerancia al calor con una disminución concomitante en la producción o translocación de nutrientes (es decir, la propensión a la simbiosis) debido a los cambios ambientales. Por lo tanto, se deben utilizar métodos potentes de un solo juvenil, como la cuantificación del uso de oxígeno a través de la microrrespirometría, para comprender los mecanismos fundamentales relacionados con el metabolismo y luego aplicarlos a cuestiones de conservación, como la comprensión de la adquisición de tolerancia al calor. Se presenta aquí como una herramienta de microrrespirometría para medidas fisiológicas, destinada a indagar la relación nutricional entre los juveniles de coral y sus simbiontes algas, pero adecuada para otros pequeños organismos marinos.
El uso o la producción de oxígeno por parte de los organismos puede medirse colocándolos en cámaras de respirometría individuales herméticamente cerradas o «respirómetros» (en lo sucesivo, «cámaras»), donde el cambio de oxígeno se mide mediante optodios3. Los optódes son sondas que miden la concentración de oxígeno mediante pulsos de luz, y el registro de las mediciones a lo largo del tiempo permite calcular las tasas de respiración y/o fotosíntesis. En la práctica, la medición de la respiración es similar a la medición de la fotosíntesis en los corales, excepto que los corales se incuban en total oscuridad. Al restar la respiración diaria total del coral y los simbiontes de la fotosíntesis diaria total, se obtiene un diferencial de oxígeno (delta de oxígeno)2,3. Generalmente, los organismos utilizan más oxígeno del que producen, lo que resulta en un déficit. Esto se puede convertir en equivalentes de carbono, ya que el oxígeno y el carbono se consumen en una proporción fija2. El excedente de carbono puede ser utilizado por el coral para el crecimiento, la síntesis y reproducción de moco y otras necesidades metabólicas esenciales12.
Este protocolo describe un método de micro-respiración (Figura 1) que se empleó para medir las tasas de respiración (R) para juveniles de coral individuales utilizando un diseño de cámara de vidrio de 1,5 mL hecho a medida (vial con rosca GL25 y 20 mm de altura, con protuberancia/cresta, borde de suelo plano y tapón de rosca con orificio; ver Tabla de Materiales) lleno de agua de mar filtrada de 0,5 μm. Se insertaron ópdos de fibra óptica (ver Tabla de Materiales) en cada cámara a través de un orificio en el costado de la tapa. Cada coral individual se fijó sobre una plataforma de placa agitadora de flujo continuo de malla dura sobre una barra de agitación magnética para garantizar una mezcla adecuada de agua dentro de la cámara. En el ejemplo representativo aquí, se midieron dos controles o “espacios en blanco” (cámaras que eran idénticas excepto por la presencia de la muestra) simultáneamente a las tres cámaras de muestras replicadas, ya que teníamos varios controladores funcionando simultáneamente. Sin embargo, el ejemplo de configuración (Figura 2) solo muestra el uso de cuatro canales; Esto se puede aumentar utilizando múltiples controladores y múltiples soportes de flujo continuo. La temperatura también se puede controlar en este sistema sumergiendo cada cámara en un baño de agua hecho a medida con temperaturas de agua preestablecidas (27 °C para el control o 31 °C para el estrés por alta temperatura en los datos de ejemplo aquí) utilizando un sistema de flujo continuo y suave establecido en 75 L/h). La plataforma de la placa agitadora y la placa agitadora con engranajes pueden ser de cualquier tamaño y pueden hacerse tan grandes o tan pequeñas como sea necesario para acomodar el número de cámaras de vidrio. En este ejemplo, la plataforma y la placa eran de unos 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabla de materiales). La calibración de los optódosos se realizó antes de cada corrida utilizando dos soluciones estándar que representan una saturación de oxígeno del 0% y del 100% a la temperatura y salinidad del agua apropiadas para este entorno experimental.
Este trabajo describe la construcción de una configuración de microrrespirometría hecha a medida que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de oxígeno consumido y producido por pequeños organismos acuáticos sésiles. Los componentes críticos de este protocolo incluyen la configuración de las cámaras, incluidos los puntos, y la calibración de la señal baja utilizando el paquete respR , en el que una señal baja se puede definir como velocidades caracterizadas por pendientes poco profundas o ruidosas. La cámara personalizada y su configuración permiten la detección incluso de señales bajas, mientras que el uso del paquete R ayuda a proteger contra problemas en los que la aparición de pendientes poco profundas o ruidosas podría conducir a la interpretación errónea de los resultados (por ejemplo, falsos positivos).
Las posibles modificaciones que serán necesarias para otros usuarios incluyen la fijación del organismo de interés dentro de la cámara hecha a medida. En este caso, se utilizó una brida pequeña y rígida y pegamento de acuario para asegurar al juvenil a la base de plástico, que luego se pegó a la corbata. Cabe señalar que, para este experimento, los juveniles de coral se asentaron sobre láminas de plástico negro. Este plástico permitió la fácil eliminación de los juveniles de coral, que se deslizaron efectivamente fuera del plástico, para no dañarlos físicamente durante la eliminación. Los juveniles de coral se adhieren al sustrato sobre el que se asientan, por lo que se recomienda asentarlos sobre un material plástico similar, utilizando un péptidoartificial 16 para facilitar su eliminación para el proceso de pegado. Para minimizar aún más el estrés de manipulación y el impacto en la respuesta respiratoria, se recomienda permitir que los corales montados en bridas se aclimaten durante 1-2 semanas, como es común en muchos experimentos de estrés de corales adultos. Es posible que se necesiten otras modificaciones para asegurar el organismo por encima de la mancha en el párpado y permitir la circulación del agua. Otro paso clave para la resolución de problemas es la detección de señales, específicamente en la pendiente de la serie temporal de oxígeno donde se deben determinar las velocidades. En última instancia, esto se reduce a una combinación de usar el buen juicio para excluir datos obviamente inestables y las funciones dentro de respR para permitir que las tasas se extraigan de regiones elegidas de manera consistente o automáticamente mediante la identificación de regiones lineales de los datos. Más ejemplos de cómo hacerlo están disponibles en el sitio web de respR .
Este método se desarrolló para extender las mediciones del límite inferior de la respiración a invertebrados marinos extremadamente pequeños y sésiles. La limitación obvia es que este protocolo puede ser más propenso a falsos positivos en comparación con los protocolos diseñados para biomasas más grandes. Sin embargo, dado que este era el objetivo del diseño, medir estos límites inferiores, esto se ha tenido en cuenta en el diseño, y el procedimiento se puede utilizar con el paquete respR para protegerse mejor contra los falsos positivos. También es importante reconocer que existen otros sistemas para medir la respiración30 y la medición de organismos pequeños, incluida la respirometría en copépodos individuales31 en volúmenes más pequeños que este (~0,5-1 mL), pero son costosos o carecen de componentes específicos (capacidad de agitación). Sin embargo, este sistema es de código abierto y de costo relativamente bajo en comparación con los sistemas comerciales (por ejemplo, el sistema de microplacas centrales). Este sistema también incorpora consideraciones metodológicas clave como la agitación, de la que pueden carecer otros sistemas. La función de barra de agitación interna es esencial para replicar la mezcla natural de agua de muchos organismos marinos (por ejemplo, copépodos a través de la natación), que a menudo no es posible y puede hacer que los datos sean en gran medida inutilizables. Por el contrario, otros métodos de mezcla disponibles consisten en colocar todo el respirómetro en un banco basculante gigante, que requiere equipo adicional y tiene un éxito limitado en la mezcla, o mezclar por vibración, lo que puede causar perturbaciones en el organismo. Por esta razón, este es el único sistema que puede realizar la respirometría en corales juveniles u otros organismos sésiles muy pequeños. Como referencia, el rango de tamaño de los especímenes incluidos aquí osciló entre 2,1 y 3,6 pólipos (correspondientes a solo unos pocos meses de edad), con un área media mínima a máxima de 1,3 a 4,5 mm2.
La respirometría es una medida fundamental en los estudios ecológicos, y existen muchos métodos para este fin. Sin embargo, la mayoría de estos métodos existentes se dirigen a muestras de alta biomasa, incluidos peces enteros, fragmentos de coral o pastos marinos 32,33,34. Este método es el primero en utilizar juveniles de coral individuales. Además, son muchas las aplicaciones potenciales de este método, ya que proporciona información fisiológica clave sobre el funcionamiento del organismo. Esto puede ser importante para los estudios que buscan caracterizar las estimaciones de salud de referencia35, comprender el papel del estrés agudo o a largo plazo durante la ontogenia de los corales, como el estrés por calor36, o proporcionar umbrales que los administradores pueden establecer para ayudar a proteger y mejorar la salud de los arrecifes de coral37. Dado que el coral es un holobionte y la comunidad simbionte es relativamente flexible en esta etapa y a lo largo del primer año de vida38, sería interesante emparejar los datos de la respirometría con los cambios en las comunidades a lo largo del tiempo, para contextualizar completamente el funcionamiento del organismo en su conjunto. Es importante destacar que este método contribuye a las técnicas de “ciencia abierta” que ayudan a proporcionar un esquema para crear configuraciones experimentales personalizadas que se pueden compartir, mejorar y estandarizar abiertamente.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Sam Noonan por su ayuda y consejos, a Sven Uthicke por el uso de las cámaras de respirometría iniciales, a Ben Shelab por su ilustración de ingeniería y al taller del Instituto Australiano de Ciencias Marinas por el mecanizado a medida de adaptadores y soportes de cámaras de respirometría. Los corales fueron recolectados bajo el siguiente permiso del Parque Marino de la Gran Barrera de Coral según AIMS G12 / 35236.1. Los corales no requieren permisos éticos.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |