本文旨在为研究人员提供详细且易于理解的指南,以建立失血性休克的婴儿猪模型。
失血性休克是儿科患者发病和死亡的主要原因。由于该人群固有的异质性,很难解释在成人中验证的临床指标以指导复苏和不同疗法之间的比较。因此,与成人相比,小儿失血性休克的适当管理仍未得到很好的确立。此外,失血性休克儿科患者的稀缺性排除了临床相关研究的发展。因此,有必要建立实验性儿科动物模型来研究儿童出血的影响以及他们对不同疗法的反应。我们提出了麻醉幼猪容量控制失血性休克的婴儿动物模型。通过抽取先前计算的血容量来诱导出血,随后用不同的疗法对猪进行监测和复苏。在这里,我们描述了一种精确且高度可重复的未成熟猪失血性休克模型。该模型产生的血流动力学数据表征了因严重出血而激活的代偿机制。
创伤导致的危及生命的出血虽然不常见,但却是儿科患者死亡的主要原因1,2。失血性休克的其他病因包括出血热、消化道出血、肝脏手术和心脏手术,尤其是使用体外循环时3.
与成年人群相反,关于小儿失血性休克管理的数据不足,主要基于专家意见或直接从成人实践翻译而来 2,4。然而,成人对管理策略的翻译可能并不合适。例如,由于不同年龄组之间存在生理异质性以及儿科人群中占主导地位的不同损伤模式,因此在成人中验证的临床指标很难外推到儿科患者。因此,触发儿科患者干预的具体终点尚不明确。此外,没有足够的证据表明目前在成人中实施的疗法可能对儿童产生有害影响2,4,5。
鉴于所有这些,需要进一步研究以确定特定的复苏阈值以提示干预,并更好地确定哪种疗法是小儿失血性休克最合适的治疗方法。然而,由于患者匮乏以及从新生儿期到青春期的儿科人群中已经提到的异质性,儿童危及生命的出血的高质量和临床相关研究的发展是困难的。
失血性休克的临床相关性,除了对儿科患者进行临床研究的困难外,还强调了对动物模型进行临床前评估的必要性,以研究儿童失血性休克后的病理生理学,以及比较不同的疗法。几种动物模型已被广泛用于研究失血性休克6、7、8、9 的研究。由于猪在解剖学和生理学上与人类相似,因此在生物医学研究中受到高度重视。关于使用特定婴儿模型的优势,有证据表明,未成熟的猪血流动力学以及呼吸、血液和代谢系统与年轻人的血流动力学高度相似9。这为模拟儿童失血性休克的临床场景提供了独特的机会。
在该模型中,通过抽取先前计算的血容量来诱导出血。随后,对猪进行监测,并给予不同的复苏液。
在这里,我们描述了一种精确且高度可重复的未成熟猪失血性休克模型。该模型产生的血流动力学数据表征了为应对严重出血而激活的代偿机制。
由于这些动物的某些解剖学和生理学特征,对幼猪进行手术可能很复杂,并且可能危及生命。为了获得一致的结果并减少动物的损失,应仔细考虑一些关键步骤。首先,达到足够的镇静水平对于最大限度地减少动物应激反应至关重要,如果过度,可能会因内源性儿茶酚胺释放而改变结果。避免肌肉注射和插管之间的延迟也很重要,因为动物可能会出现严重的应激反应,伴有心动过速和不可逆的代谢性酸中毒,这可能会加速实验的结束。尽管其他组使用吸入麻醉剂效果良好20,21,但我们更喜欢静脉注射药物,因为吸入镇静剂不允许通过间接量热法测量呼吸气体交换。根据我们的经验,异丙酚和芬太尼的组合是有效的,几乎没有不良反应。在整个实验过程中仔细的温度管理是该协议的另一个关键方面,因为温度的快速变化会显着影响动物对休克的血流动力学反应,伪造结果或最终导致实验失败。
器械的另一个关键部分是插管,因为猪的解剖结构及其对喉痉挛的易感性。因此,该程序应由至少一名具有先前经验的操作员执行,并且建议使用管心针和肌肉松弛10,22。由于动物的体型较小,血管导管插入术也可能具有挑战性。对于股骨通路,超声引导下穿刺是可取的,因为血管位于深处,通常直径较小,并显示不同的路线和位置22。对于颈椎通路,我们使用手术通路来放置颈动脉流量探头,但超声技术也是可行的23,24。颈外静脉插管通常是首选,因为它的直径较宽,位置浅表,周围结构数量较少22。插入后应立即用生理盐水冲洗导管,以防止闭塞。我们不使用肝素来避免凝血改变。此外,最初,我们避免给予葡萄糖输注,以防止因给予额外的液体而可能扭曲血流动力学反应,但我们发现动物出现了严重的早期低血糖症。最后,即使使用麻醉和现在使用的侵入性较小的技术,器械也会在动物中产生显着的应激反应,因此在开始抽血之前留出足够的恢复时间是可取的。关于失血性休克的诱发,我们建议去除30mL/kg,因为这会产生显著的病理生理反应,且存活率极高。根据我们的经验,幼猪不能忍受大量的失血,死亡率很高。逐渐抽血也很重要,因为快速抽血会导致严重的血流动力学不稳定和动物过早死亡。
尽管研究人员可以使用各种各样的物种和实验模型,但动物失血性休克的理想模型——简单、易于重现和准确复制临床情况——仍然是一个挑战。小动物模型(主要是小鼠和大鼠)用于研究休克的病理生理机制。然而,它们的小尺寸使外科手术和取样程序的性能大大复杂化。较大的动物,如狗和猪,更昂贵且处理起来更复杂,但它们的大小和与人类的生理相似性使它们更适合治疗策略的临床前评估。然而,过去和现在使用狗在道德上是值得怀疑的。作为实验动物模型,它们与猪相比没有任何优势,它们的智力以及人与狗之间的特殊双边关系使它们在系统发育尺度中处于更高的位置6,7,8。
有鉴于此,成年猪因其与成年人类的生理学、体型和解剖结构相似而被广泛用于心血管研究,这比大多数物种都要好。然而,正如文献中已经确定的那样,人类成人和儿童患者在心血管系统、血容量、体温调节和对休克的反应方面存在显着差异 2,3,4。同时,有证据表明,这些差异也适用于猪,并且已发现仔猪的心血管、脑血管、血液学和电解质特征与儿科人类患者非常相似 9,25。最后,除了两个物种的成人和婴儿之间的这些解剖学和生理学差异之外,使用婴儿动物模型,特别是迷你猪,提供了测试在真实临床环境中用于监测的相同设备的机会。在许多情况下,由于对成人算法、传感器或秤的简单调整,这些设备的可靠性已被证明是低的。所有这些方面都支持开发特定儿科动物模型的重要性及其在转化效用方面与儿科临床环境的相关性。
除了动物的类型外,在失血性休克的研究中通常使用三种基本模型:控制性出血(通过容量或压力)和不受控制的出血。本文中介绍的方案描述了一种固定体积出血模型,其中固定的血容量(通常由体重百分比计算)在观察者设定的时间段内被移除。相反,在固定压力出血模型中,动物被放血至预定的 MAP,然后在指定时间段内通过定期出血或输液来维持该 MAP,具体取决于动物种类和休克的程度或结果。固定容积和固定压力出血性休克模型都允许在受控条件下研究休克引起的病理生理变化,在可重复性和标准化方面具有明显的优势。然而,它们的主要局限性在于它们不允许研究不同复苏策略对活动性出血的影响,其中已知在手术控制出血之前进行积极的液体复苏会增加出血并降低生存率,因为抑制血栓的形成和平均血压的升高。由标准化血管创伤(肝脾挤压/撕裂伤、动脉损伤或附件截肢)引起的不受控制的出血模型已被建议更好地反映临床情况,从而可以更好地了解不同液体复苏策略和其他干预措施(如低温和止血产品)的效果。然而,尽管在临床上最相关,但这些不受控制的出血模型在标准化和可重复性方面存在一些明显的缺点。鉴于这一切,理想的模型似乎并不存在,因此该领域的研究必须在临床相关性与实验标准化和可靠性之间取得平衡6,7,8,9,26。
本研究中描述的模型可能在心血管研究中提供广泛的潜在应用,例如研究休克期间的内皮功能障碍和微循环改变18,以及验证不同的血流动力学监测系统。此外,它还可用于其他研究领域,允许研究严重出血后的内分泌或免疫反应,以及测定不同液体和血管加压药的副作用。然而,关于对不同复苏策略的研究,建议在临床环境中实施更改之前研究它们在不受控制的出血模型中的影响7,26。
除了难以将结果外推到现实生活中外,该模型还有其他局限性。首先,有一些与实验设置相关的混杂变量,例如使用麻醉剂或机械通气,这可能会减弱休克期间的生理反应并使结果解释复杂化。此外,仪器对动物的应激响应和温度控制可能通过不同的机制影响宏观和微观循环。该模型的另一个重要局限性 – 与实验必需品和资源可用性有关 – 是有限的创伤后观察期,这进一步限制了对失血性休克长期后果的研究。此外,尽管人类和猪在生理上相似,但物种之间存在一些差异,需要考虑。例如,凝固系统似乎在猪中更有效 27,28。此外,不同物种的乳酸和琥珀酸血浆水平不同,猪有基础碱中毒,这可能导致低估出血对酸碱平衡的影响29。最后,众所周知,猪9 的炎症和免疫反应以及一些血管加压受体是不同的。特定的动物差异也需要被视为影响因素。几项研究表明,在对休克的易感性方面存在性别差异,女性比男性具有显着的生存优势6,9。然而,在这项研究进行的实验中,我们使用来自同一年龄组和具有相似遗传背景的动物,以尽量减少物种固有的潜在变异性。
总之,本文为建立小儿失血性休克猪模型提供了实用的分步指南。与其他现有模型相比,这是一种可靠且易于遵循的方案,在生物医学研究中具有广泛的适用性,无论是用于研究严重出血后的病理生理反应还是用于评估不同的复苏策略。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由卡洛斯三世健康研究所 (ISCIII) 通过“PI20/01706”项目资助,并由欧盟共同创立。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。我们要感谢格雷戈里奥·马拉尼翁儿科重症监护室和格雷戈里奥·马拉尼翁实验研究所的所有同事,因为没有他们的工作,这个项目就不可能实现。
ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
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Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
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