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Neurociência

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64826
, , , ,
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry,University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences,University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

Abstract

A imagem por Ca 2+ pode ser usada como proxy da atividade celular, incluindo potenciais de ação e vários mecanismos de sinalização envolvendo a entrada de Ca 2+ no citoplasma ou a liberação de depósitos intracelulares de Ca2+. A imagem de Ca2+ baseada em Pirt-GCaMP3 de neurônios sensoriais primários do gânglio da raiz dorsal (DRG) em camundongos oferece a vantagem da medição simultânea de um grande número de células. Até 1.800 neurônios podem ser monitorados, permitindo que redes neuronais e processos somatossensoriais sejam estudados como um conjunto em seu contexto fisiológico normal em nível populacional in vivo. O grande número de neurônios monitorados permite a detecção de padrões de atividade que seriam difíceis de detectar usando outros métodos. Os estímulos podem ser aplicados na pata traseira do camundongo, permitindo que os efeitos diretos dos estímulos no conjunto de neurônios DRG sejam estudados. O número de neurônios produzindo transientes de Ca 2+, bem como a amplitude de transientes de Ca2+, indica sensibilidade a modalidades sensoriais específicas. O diâmetro dos neurônios fornece evidências de tipos de fibras ativadas (fibras mecanas não nocivas vs. fibras dolorosas nocivas, fibras Aβ, Aδ e C). Neurônios que expressam receptores específicos podem ser geneticamente marcados com td-Tomato e recombinases específicas de Cre juntamente com Pirt-GCaMP. Portanto, a imagem Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fornece uma poderosa ferramenta e modelo para a análise de modalidades sensoriais específicas e subtipos de neurônios atuando como um conjunto em nível populacional para estudar dor, coceira, toque e outros sinais somatossensoriais.

Introduction

Os neurônios sensoriais primários inervam diretamente a pele e transportam informações somatossensoriais de volta ao sistema nervoso central 1,2. Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são aglomerados de corpos celulares de 10.000-15.000 neurônios sensoriais primários 3,4. Os neurônios DRG apresentam diversos tamanhos, níveis de mielinização e padrões de expressão gênica e receptora. Neurônios de menor diâmetro incluem neurônios sensíveis à dor e neurônios de maior diâmetro tipicamente respondem a estímulos mecânicos não dolorosos 5,6. Distúrbios nos neurônios sensoriais primários, como lesão, inflamação crônica e neuropatias periféricas, podem sensibilizar esses neurônios a vários estímulos e contribuir para dor crônica, alodínia e hipersensibilidade à dor 7,8. Portanto, o estudo dos neurônios DRG é importante na compreensão da somatosensação em geral e de muitos transtornos de dor e coceira.

Neurônios disparando in vivo são essenciais para a somatosensação, mas até recentemente, ferramentas para estudar gânglios intactos in vivo eram limitadas a um número relativamente pequeno de células 9. Aqui, descrevemos um método poderoso para estudar os potenciais de ação ou atividades de neurônios em nível populacional in vivo como um conjunto. O método emprega imagens baseadas na dinâmica citoplasmática do Ca2+. Os indicadores fluorescentes sensíveis ao Ca 2+ são bons proxies para medir a atividade celular devido à concentração normalmente baixa de Ca2+ citoplasmático. Esses indicadores têm permitido o monitoramento simultâneo de centenas a vários milhares de neurônios sensoriais primários em camundongos 9,10,11,12,13,14,15,16 e ratos 17. O método de imagem in vivo de Ca2+ descrito neste estudo pode ser usado para observar diretamente as respostas em nível populacional a estímulos mecânicos, frios, térmicos e químicos.

A proteína de membrana ligadora de fosfoinositídeos, Pirt, é expressa em níveis elevados em quase todos (>95%) neurônios sensoriais primários18,19 e pode ser usada para conduzir a expressão do sensor Ca 2+, GCaMP3, para monitorar a atividade dos neurônios in vivo20. Neste protocolo, são descritas técnicas para a realização de cirurgia DRG in vivo, imagem por Ca2+ e análise no DRG lombar 5 (L5) direito de camundongos Pirt-GCaMP314 usando microscopia confocal de varredura a laser (LSM).

Protocol

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio. NOTA: Uma vez iniciadas, a cirurgia dos animais (etapa 1) e os exames de imagem (etapa 2) devem ser concluídos de forma contínua. A análise dos dados (etapa 3) poderá ser realizada posteriormente. 1. Cirurgia e fixação do animal para ima…

Representative Results

Figura 4: Imagens representativas dos gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3. (A,D) Imagens de alta resolução de quadro único de gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3 são mostrados. (B,E) . Projeções de intensidade média de 15 quadros dos gânglios do Pirt-GCa…

Discussion

A dor persistente está presente em uma ampla gama de distúrbios, debilitando e/ou reduzindo a qualidade de vida de cerca de 8% das pessoas29. Os neurônios sensoriais primários detectam estímulos nocivos na pele, e sua plasticidade contribui para a dor persistente8. Enquanto os neurônios podem ser estudados em cultura celular e explantes, fazê-lo os remove de seu contexto fisiológico normal. A exposição cirúrgica do DRG, seguida de Pirt-GCaMP3 Ca2+, per…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (para Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) e um Rising STAR Award da University of Texas system (Y.S.K.).

Materials

Anased Injection (Xylazine) Covetrus, Akorn 33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC Cal Zeiss 422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators McKesson 24-106-1S
Curved Hemostat Fine Science Tools 13007-12
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad FHC 40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps Fine Science Tools 11252-50
FHC DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fluriso (Isoflurane) MWI Animal Health, Piramal Group 501017
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16221-14
GelFoam Pfizer 09-0353-01
Ketaset (Ketamine) Zoetis KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape JSITON/ Amazon B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer Midmark 91305430
Micro dissecting scissors Roboz RS-5882
Micro dissecting spring scissors Fine Science Tools 15023-10
Micro dissecting spring scissors Roboz RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe FHC 40-90-5D-02
Operating scissors Roboz RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice Johns Hopkins University N/A Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer Bioseb In vivo Research Instruments BIO-SMALGO
Stereotaxic frame Kopf Model 923-B 923-B
td-Tomato C57BL/6J mice Jackson Laboratory 7909
Top Plate, 6 in x 10 in Newport 290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice Jackson Laboratory 17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope Cal Zeiss LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software Cal Zeiss Zen (Blue Edition) 2.6
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Referências

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Citar este artigo
Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (192), e64826, doi:10.3791/64826 (2023).
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