明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制造、冻干、化学组装和 3D 生物打印

Summary

本文介绍了使用微流体装置制造高通量明胶甲基丙烯酰基微凝胶的协议，将微凝胶转化为可重悬粉末（微气凝胶），微凝胶的化学组装以形成颗粒水凝胶支架，以及开发具有保留微孔隙率的颗粒水凝胶生物墨水用于3D生物打印。

Abstract

通过组装水凝胶微粒（HMP） 制造的 颗粒水凝胶支架（GHS）的出现使微孔支架能够原 位形成。与传统的块状水凝胶不同，GHS中互连的微尺度孔有助于与降解无关的细胞浸润以及氧气，营养和细胞副产物的转移。甲基丙烯酰基改性明胶（GelMA）是一种（光）化学可交联的蛋白质基生物聚合物，含有细胞粘合剂和可生物降解的部分，已被广泛用作细胞响应/指导性生物材料。将散装GelMA转化为GHS可能会为组织工程和再生带来大量机会。在本文中，我们展示了高通量GelMA微凝胶制造，转化为可重悬的干燥微凝胶（微气凝胶），通过微凝胶的化学组装 形成 GHS以及用于挤出生物打印的颗粒生物墨水制造的过程。我们展示了通过冷却和光交联的顺序物理化学处理如何能够形成机械坚固 的 GHS。当光线无法接触时（例如，在深层组织注射期间），可以使用谷氨酰胺转移酶通过酶促交联 进行 生物正交组装单独交联的 GelMA HMP。最后，通过多相带电纳米颗粒的界面自组装 ，证明了 低HMP堆积密度下微孔GHS的三维（3D）生物打印。

Introduction

组装HMP构建块以形成组织工程支架在过去几年中获得了极大的关注¹。通过HMP组件制造的GHS与散装同类产品相比具有独特的性能，包括源自离散构建块之间的空隙的细胞级微孔隙。其他特性，如注射性、模块化和刚度与孔隙率的解耦，使 GHS 成为增强组织修复和再生的有前途的平台².不同的生物材料已被用于GHS制造，包括合成PEG基聚合物³，⁴和多糖，如藻酸盐⁵和透明质酸^6，7。在天然衍生聚合物中，用于GHS制造的最常见的基于蛋白质的生物聚合物是GelMA⁸，⁹，^10，11，这是一种可交联，生物相容性，生物粘附性和可生物降解的生物材料^12，13。

HMP可以通过间歇乳化⁸、流动聚焦14、15或分步乳化9、11微流体装置、共混16或复合聚结^17、18来制备。通常，制造吞吐量和HMP单分散性之间存在权衡。例如，混合技术产生不规则形状和高度分散的HMP。 间歇乳化或复杂凝聚能够生产大量多分散球形HMP。 聚焦流动微流体装置已被用于制造变异系数为<5%的高度单分散液滴，但通量显着降低。在分步乳化微流体器件中，高度并行化的步骤能够实现单分散HMP的高通量制造¹⁹。

甲基丙烯酰改性明胶 （GelMA） HMP 构建块具有热响应性和（光）化学交联性，可实现轻松的 GHS 制造²⁰。当冷却到临界溶液温度（UCST）²¹以下（例如，在4°C下）时，含有GelMA溶液的液滴转化为物理交联的HMP。然后利用外力（例如，通过离心）填充这些 HMP 构建块以产生卡住的微凝胶悬浮液。通过（光）化学交联在相邻的HMP之间建立颗粒间链接，以形成机械坚固的GHS¹⁴。GHS最重要的特性之一是微孔率，使体外细胞易于渗透¹¹，并增强体内组织向内生长²²。HMP的三维（3D）生物打印通常使用紧密包装的微凝胶悬浮液进行，这会影响微孔²³。

我们最近开发了一类基于GelMA微凝胶的界面纳米工程的新型颗粒生物墨水，通过吸附带异质电荷的纳米颗粒 ， 然后纳米颗粒可逆自组装。该策略使松散包装的微凝胶剪切产量和挤出3D可生物打印，从而保留了增材制造的GHS¹¹的微尺度孔隙率。本文介绍了高通量 GelMA 液滴制造方法、将这些液滴转化为物理交联的 HMP、使用可重悬粉末制造 GelMA HMP、GelMA GHS 形成、GelMA 纳米工程颗粒生物墨水 （NGB） 制备和 3D 生物打印。

Protocol

注意：有关本协议中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。 1. 凝胶MA合成 注意：GelMA合成应在化学通风橱中进行，并应始终使用适当的个人防护设备（PPE）。 将200mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS，1x）加入锥形瓶中，并将溶液加热至达到50°C。 用铝箔盖住烧瓶以防止蒸发。 在50°C下向DPBS溶液中…

Representative Results

GelMA是通过明胶与MA的反应合成的，如图 1A所示。通过调整反应条件，如MA浓度，得到不同程度的MA取代。为了量化MA取代的程度， 通过1H NMR波谱评估GelMA（图1B）。在~5-6 ppm的化学位移处具有代表性峰的乙烯基官能团证实了明胶成功合成GelMA。透析和无菌过滤后的反应收率为>70%（mg的GelMA/mg的明胶）。液滴/微凝胶制备产率为~100%。可以使用?…

Discussion

明胶及其衍生物是HMP制造中最常用的基于蛋白质的生物材料。使用步进乳化微流体装置可以克服通量与粒径单分散性权衡的挑战。这些装置每小时能够形成超过4000万个液滴，变异系数小于5%²⁷。在本文中，我们讨论了含有GelMA溶液的液滴的微细加工，然后将其转化为GelMA HMP，粉末，GHS和NGB。

GelMA的热响应性使微流体的HMP制造和稳定变得简单。在高于UCST的温度?…

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98% purity
Biopsy punch	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		NMR device
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5415 C
Centrifuge tube	Celltreat, MA ,USA	229423
Coffee filters	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide	Sigma, MA, USA	151882
Dialysis membrane (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Ethanol	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
Freeze dryer	Labconco, MO, USA	71042000	Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides	VWR, PA, USA	82027-788
Hotplate	FOUR E'S SCIENTIFIC	MI0102003	5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 negative photoresist series	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok connector	BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜSS MicroTeck, German		Nanofabrication device
Methacylate anhydride	Sigma, MA, USA	276685-100ML	contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid	3M, MN, USA		3M ID 7100003723
Oven	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Vacuum Oven
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pasteur pipette	VWR, PA, USA	14673-010
Petri dish	VWR, PA, USA	25384-092	polystyrene
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette	VWR, PA, USA	89079-970
Pipette tips	VWR, PA, USA	87006-060
Plasma cleaner chamber	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polydimethylsiloxane	Dow Corning, MI, USA	2065623	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Silicon wafers	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4-inch mechanical grade
Spatula	VWR, PA, USA	231-0104	Disposable
SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon tubings	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
UV light	QUANS		Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 µm
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini Vortex Mixer