פיגומי הידרוג'ל גרגיריים מג'לטין מתקרילויל: ייצור מיקרוג'ל בתפוקה גבוהה, ליופיליזציה, הרכבה כימית והדפסה ביולוגית תלת-ממדית

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מיקרו-ג’ל ג’לטין מתקרילויל בתפוקה גבוהה באמצעות התקנים מיקרופלואידים, המרת מיקרו-ג’לים לאבקה מתרחפת (מיקרו-אירוג’לים), הרכבה כימית של מיקרו-ג’לים ליצירת פיגומי הידרוג’ל גרגיריים, ופיתוח ביו-דיו הידרוג’ל גרגירי עם מיקרו-נקבוביות משומרת להדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

Abstract

הופעתם של פיגומי הידרוג’ל גרגיריים (GHS), המיוצרים באמצעות הרכבת מיקרו-חלקיקי הידרוג’ל (HMPs), אפשרה היווצרות פיגומים מיקרו-נקבוביים באתרם. שלא כמו הידרוג’לים קונבנציונליים בתפזורת, נקבוביות מיקרוסקוליות מחוברות זו לזו ב-GHS מאפשרות חדירת תאים שאינה תלויה בהתפרקות, כמו גם העברת חמצן, חומרים מזינים ותוצרי לוואי של תאים. ג’לטין מהונדס Methacryloyl (GelMA), ביופולימר מבוסס חלבון הניתן להצלבה כימית המכיל דבק תאים ומויטי מתכלים, נמצא בשימוש נרחב כחומר ביולוגי מגיב לתאים/מאלף. המרת GelMA בתפזורת ל- GHS עשויה לפתוח שפע של הזדמנויות להנדסת רקמות והתחדשות. במאמר זה, אנו מדגימים את ההליכים של ייצור מיקרו-ג’ל GelMA בתפוקה גבוהה, המרה למיקרו-ג’לים יבשים הניתנים להשעיה חוזרת (מיקרו-אירוג’לים), היווצרות GHS באמצעות הרכבה כימית של מיקרו-ג’לים, וייצור ביו-דיו גרעיני להדפסה ביולוגית של אקסטרוזיה. אנו מראים כיצד טיפול פיסיקוכימי רציף באמצעות קירור ופוטוקרוסלינקינג מאפשר היווצרות GHS חזק מבחינה מכנית. כאשר האור אינו נגיש (למשל, במהלך הזרקת רקמות עמוקה), ניתן להרכיב ביו-אורתוגונלים של GelMA HMPs מוצלבים בנפרד באמצעות קרוסלינקינג אנזימטי באמצעות טרנסגלוטמינאזות. לבסוף, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית) של GHS מיקרו-נקבובי בצפיפות אריזה נמוכה של HMP מודגמת באמצעות הרכבה עצמית בין-פנים של ננו-חלקיקים הטעונים הטרוגנית.

Introduction

הרכבת אבני בניין של HMP ליצירת פיגומים הנדסיים לרקמות זכתה לתשומת לב עצומה בשנים האחרונות¹. GHS, המיוצרים באמצעות הרכבת HMP, הם בעלי תכונות ייחודיות בהשוואה למקביליהם בתפזורת, כולל מיקרופורוזיות בקנה מידה תאי שמקורן בחללים החלקיים בין אבני הבניין הבדידות. תכונות נוספות, כגון יכולת הזרקה, מודולריות ונוקשות מנותקת מנקבוביות, הופכות את GHS לפלטפורמה מבטיחה לשיפור תיקון רקמות והתחדשות². ביו-חומרים שונים שימשו לייצור GHS, כולל פולימרים סינתטיים מבוססי PEG^3,4 ורב-סוכרים, כגון אלגינט⁵ וחומצה היאלורונית ^6,7. מבין הפולימרים ממקור טבעי, הביופולימר מבוסס החלבון הנפוץ ביותר לייצור GHS הוא GelMA 8,9,10,11, חומר ביולוגי^12,13 הניתן להצלבה, תואם ביולוגית^, דבק ביולוגי ומתכלה.

ניתן לייצר HMPs באמצעות תחליב אצווה⁸, מיקוד זרימה 14,15 או תחליב שלב^9,11 התקנים מיקרופלואידים, ערבוב 16, או coacervation^{מורכב 17,18}. בדרך כלל, יש פשרה בין תפוקת הייצור לבין חד-פיזור HMP. לדוגמה, טכניקת המיזוג מניבה HMPs בעלי צורה לא סדירה ומפוזרים מאוד. תחליב אצווה או קו-סרבציה מורכבת מאפשר ייצור של כמויות גדולות של HMPs כדוריים רב-מפוזרים. התקנים מיקרופלואידים ממוקדי זרימה שימשו לייצור טיפות חד-פזורות מאוד עם מקדם שונות של <5%, אולם התפוקה נמוכה משמעותית. בהתקנים מיקרופלואידים של תחליב צעדים, השלבים המקביליים מאוד מאפשרים ייצור בתפוקה גבוהה של HMPs^{חד-מפוזרים 19}.

אבני הבניין של HMP מג’לטין מעובד Methacryloyl (GelMA) מגיבות לחום וניתנות להצלבה כימית, מה שמאפשר ייצור GHS קל²⁰. עם קירור מתחת לטמפרטורת התמיסה הקריטית העליונה (UCST)²¹ (למשל, ב-4°C), טיפות המכילות תמיסת GelMA מומרות לקופות חולים מוצלבות פיזית. אבני בניין אלה של HMP נארזות לאחר מכן באמצעות כוחות חיצוניים (למשל, באמצעות צנטריפוגה) כדי להניב מתלי מיקרוג’ל תקועים. קשרים בין חלקיקים נוצרים בין HMPs סמוכים באמצעות קרוסלינקינג כימי (פוטו) ליצירת GHS¹⁴ חזק מכנית. אחת התכונות החשובות ביותר של GHS היא מיקרופורוזיות, המאפשרת חדירה קלה של תאים במבחנה¹¹ וצמיחה מוגברת של רקמות in vivo²². הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית) של HMPs מתבצעת באופן קונבנציונלי באמצעות מתלי מיקרו-ג’ל צפופים, תוך התפשרות על מיקרו-נקבוביות²³.

לאחרונה פיתחנו סוג חדש של ביו-דיו גרעיני המבוסס על ננו-הנדסה בין-פנים של מיקרו-ג’לים GelMA באמצעות ספיחה של ננו-חלקיקים טעונים הטרוגנית, ולאחר מכן הרכבה עצמית הפיכה של ננו-חלקיקים. אסטרטגיה זו הופכת מיקרו-ג’לים ארוזים באופן רופף למניבי גזירה ושחול להדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המשמרת את הנקבוביות בקנה מידה מיקרוסקולרי של GHS¹¹ המיוצר בתוספים. מאמר זה מציג את השיטות לייצור טיפות GelMA בתפוקה גבוהה, המרת טיפות אלה ל- HMPs מוצלבים פיזית, ייצור HMPs של GelMA באמצעות אבקה ניתנת להשעיה, היווצרות GelMA GHS, הכנת ביודיו גרעיני ננו-מהונדס של GelMA (NGB) והדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. סינתזת GelMA הערה: סינתזת GelMA צריכה להתבצע במכסה אדים כימי, ויש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) כל הזמן. הוסף 200 מ”ל של מלח חוצץ פוספט של Dul…

Representative Results

GelMA סונתז באמצעות התגובה של ג’לטין עם MA, כפי שמוצג באיור 1A. על ידי התאמת תנאי התגובה, כגון ריכוז MA, התקבלו דרגות שונות של החלפת MA. כדי לכמת את מידת ההחלפה של MA, GelMA הוערכה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR של 1H (איור 1B). קבוצות פונקציונליות ויניל עם שיאים מייצג?…

Discussion

ג’לטין ונגזרותיו הם הביו-חומרים מבוססי החלבון הנפוצים ביותר לייצור HMP. ניתן להתגבר על האתגר של תפוקה לעומת גודל חלקיקים, ניתן להתגבר על פשרה באמצעות התקנים מיקרופלואידים של תחליב צעדים. מכשירים אלה מסוגלים ליצור יותר מ -40 מיליון טיפות בשעה, עם מקדם שונות פחות מ -5% ²⁷. במאמר זה דנו…

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98% purity
Biopsy punch	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		NMR device
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5415 C
Centrifuge tube	Celltreat, MA ,USA	229423
Coffee filters	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide	Sigma, MA, USA	151882
Dialysis membrane (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Ethanol	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
Freeze dryer	Labconco, MO, USA	71042000	Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides	VWR, PA, USA	82027-788
Hotplate	FOUR E'S SCIENTIFIC	MI0102003	5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 negative photoresist series	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok connector	BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜSS MicroTeck, German		Nanofabrication device
Methacylate anhydride	Sigma, MA, USA	276685-100ML	contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid	3M, MN, USA		3M ID 7100003723
Oven	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Vacuum Oven
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pasteur pipette	VWR, PA, USA	14673-010
Petri dish	VWR, PA, USA	25384-092	polystyrene
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette	VWR, PA, USA	89079-970
Pipette tips	VWR, PA, USA	87006-060
Plasma cleaner chamber	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polydimethylsiloxane	Dow Corning, MI, USA	2065623	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Silicon wafers	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4-inch mechanical grade
Spatula	VWR, PA, USA	231-0104	Disposable
SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon tubings	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
UV light	QUANS		Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 µm
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini Vortex Mixer