Aqui, a injeção intraperitoneal de células leucêmicas é utilizada para estabelecer e propagar a leucemia mieloide aguda (LMA) em camundongos. Este novo método é eficaz no transplante seriado de células da LMA e pode servir como uma alternativa para aqueles que podem experimentar dificuldades e inconsistências com a injeção intravenosa em camundongos.
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Artigo de método
Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há uma necessidade não atendida de novas terapias para tratar a leucemia mieloide aguda (LMA) e a recaída associada que envolve células-tronco de leucemia persistente (LSCs). Um modelo experimental de roedores com LMA para testar terapias baseadas no transplante bem-sucedido dessas células via injeções retroorbitais em camundongos receptores é repleto de desafios. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método fácil, confiável e consistente para gerar um modelo murino robusto de LMA usando uma via intraperitoneal. No presente protocolo, células da medula óssea foram transduzidas com um retrovírus expressando oncoproteína de fusão MLL-AF9 humana. A eficiência de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSCs doadoras no desenvolvimento de LMA primária foi testada, e a injeção intraperitoneal foi adotada como um novo método para gerar LMA. A comparação entre as injeções intraperitoneais e retro-orbitárias foi feita em transplantes seriados para comparar e contrastar os dois métodos. As células de Lin e LSK transduzidas com o vírus MLL-AF9 humano enxertado bem na medula óssea e no baço dos receptores, levando a uma LMA completa. A injeção intraperitoneal de células doadoras estabeleceu LMA em receptores após transplante seriado, e a infiltração de células de LMA foi detectada no sangue, medula óssea, baço e fígado dos receptores por citometria de fluxo, qPCR e análises histológicas. Assim, a injeção intraperitoneal é um método eficiente de indução de LMA utilizando transplante seriado de células leucêmicas de doadores.
Introdução
A leucemia mieloide aguda (LMA) é um tipo de neoplasia hematológica de etiologia diversa e de mau prognóstico1. A geração de modelos animais de LMA estabelece as bases para a compreensão de suas complexas variações e patobiologia em um esforço para descobrir novas terapias2. A leucemogênese em camundongos envolve o transplante de células doadoras expressando oncoproteínas de fusão, incluindo fusões envolvendo o gene da leucemia de linhagem mista (MLL) para induzir potentemente a LMA, para mimetizar a doença em humanos3. Várias origens celulares de células de doadores têm sido relatadas no transpla....
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Protocolo
Todos os experimentos foram pré-aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual da Pensilvânia.
1. Preparação de tampões e reagentes
- Preparar placas de ágar LB suplementadas com ampicilina (AP) (placas estéreis de 10 cm). Para isso, dissolva 10 g de caldo LB com ágar em 400 mL de água destilada, mexa e leve o volume até 500 mL. Esterilizar a solução por autoclavagem, em seguida, deixar a solução arrefecer, adicionar 0,5 ml de ampicilina (stock: 150 mg/ml) em solução e agitá-la para misturar. Adicionar imediatamente 18 ml de solução a uma placa estéril de 10 cm perto de uma....
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Resultados
Comparação da eficiência do transplante de células murinas de LMA utilizando as vias de transplante r.o. e i.p.
Previamente, o estabelecimento de 1° AML foi relatado em camundongos receptores transplantados retroorbitalmente com células LSK transduzidas por MLL-AF9, e a transplantabilidade de 1° de células AML foi demonstrada por transplante seriado30. O presente estudo é o primeiro a avaliar a possibilidade de utilização de células de Lin- da medula óssea para a rea.......
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Discussão
Esses estudos descritos acima fornecem evidências de suporte de que o transplante de células Lin- é comparável às células LSK na geração de 1° de LMA murina. Além disso, os dados atuais também mostram que a injeção i.p. é um método eficiente e conveniente para estabelecer LMA murina em comparação com a injeção intravenosa (ou r.o.).
Além das células LSK, outras populações, como o progenitor de granulócitos monócitos (GMP), o progenitor linfoide comum (CLP) e o progenitor mieloide co.......
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Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Flow Cytometry Core Facility do Instituto Huck e ao Histopathology Core Facility do Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, por fornecer suporte técnico oportuno. Este trabalho foi apoiado por subsídios do American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, número de adesão 00000005 ao K.S.P. e R.F.P.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| a-Selecione células competentes | Bioline | BIO-85027 | |
| Cloreto de amônio (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicilina | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Albumina de soro bovino (BSA), fração V— Bioprodutos Gemini de grau de baixa endotoxina | Cat# 700-102P | ||
| Ciprofloxacina HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, glicose alta, sem glutamina | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, sal dissódico (EDTA-2Na), di-hidratado, grau de biologia molecular | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Soro Fetal Bovino - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrina, bovino | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Solução de insulina humana | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamina 200 mM (100&vezes;) solução | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB caldo, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Caldo com ágar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Interleucina-3 de camundongo (IL-3) | Bioprodutos de gêmeos | Cat# 300-324P | |
| Interleucina-6 de camundongo (IL-6) | Bioprodutos de gêmeos | Cat# 300-327P | |
| Fator de células-tronco de camundongo (SCF) | Bioprodutos de gêmeos | Cat# 300-348P | |
| Solução de penicilina-estreptomicina, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) células | ATCC | CRL-3214 | |
| Bicarbonato de Potássio (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rato anti-rato CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rato anti-rato Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinante Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Fragmento de Fibronectina Humana Recombinante | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagente | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagente | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Solução Azul de Tripano, 0,4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho | de fenolGibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoetanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Ensaios Comerciais | |||
| Isolamento de Células Progenitoras Hematopoiéticas de Camundongo | Cat# 19856A | StemCell technologies | |
| Thermo Fisher | Cat# 4368813 | ||
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson | Laboratory Cepa # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J camundongos& nbsp; | Cepa de laboratório Jackson | # 002014 | |
| camundongos CD45.2 C57BL6/J | Cepa de Laboratório Jackson | # 000664 | |
| Instrumentos e Softwares | |||
| Adobe illustrator | Versão 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 citômetro de fluxo | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys programa de software | Versão 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism versão 6: | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Sistema de PCR em tempo real | Applied Biosystems | ||
| Syngene G: BOX Chemi XR5 Quimioluminescência Fluorescência Imaging | G: Box Chemi |
Referências
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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Reimpressões e permissões
