Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline
Summary
La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.
Abstract
La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) en cellules bêta sécrétrices d’insuline fournit du matériel pour étudier la fonction des cellules bêta et le traitement du diabète. Cependant, il reste des défis à relever pour obtenir des cellules bêta dérivées de cellules souches qui imitent adéquatement les cellules bêta humaines natives. S’appuyant sur des études antérieures, des cellules d’îlots pancréatiques dérivées de CSPh ont été générées pour créer un protocole avec des résultats de différenciation et une cohérence améliorés. Le protocole décrit ici utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pendant les stades 1 à 4, suivi d’un protocole modifié à partir d’un article précédemment publié en 2014 (appelé « protocole R » ci-après) au cours des stades 5 à 7. Des procédures détaillées pour l’utilisation du kit de progéniteurs pancréatiques et de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre pour générer des grappes de progéniteurs pancréatiques, le protocole R pour la différenciation endocrinienne dans un format de suspension statique à 96 puits, ainsi que la caractérisation in vitro et l’évaluation fonctionnelle des îlots dérivés des CSPh, sont inclus. Le protocole complet prend 1 semaine pour l’expansion initiale des CSPh, suivie de ~5 semaines pour obtenir des îlots de CSPh productrices d’insuline. Le personnel possédant des techniques de culture de cellules souches de base et une formation en essais biologiques peut reproduire ce protocole.
Introduction
Les cellules bêta pancréatiques sécrètent de l’insuline en réponse à l’augmentation de la glycémie. Les patients qui ne produisent pas suffisamment d’insuline en raison de la destruction auto-immune des cellules bêta dans le diabète de type 1 (DT1)1, ou en raison d’un dysfonctionnement des cellules bêta dans le diabète de type 2 (DT2)2, sont généralement traités par l’administration d’insuline exogène. Malgré cette thérapie qui sauve des vies, elle ne peut pas égaler avec précision le contrôle exquis de la glycémie obtenu par la sécrétion dynamique d’insuline à partir de cellules bêta authentiques. En tant que tels, les patients souffrent souvent des conséquences d’épisodes hypoglycémiques potentiellement mortels et d’autres complications résultant d’excursions hyperglycémiques chroniques. La transplantation d’îlots cadavériques humains rétablit avec succès un contrôle glycémique strict chez les patients atteints de DT1, mais elle est limitée par la disponibilité de donneurs d’îlots et les difficultés à purifier les îlots sains pour la transplantation 3,4. Ce défi peut, en principe, être résolu en utilisant les hPSC comme matériau de départ alternatif.
Les stratégies actuelles de génération d’îlots sécréteurs d’insuline à partir de CSPh in vitro visent souvent à imiter le processus de développement du pancréas embryonnaire in vivo 5,6. Cela nécessite de connaître les voies de signalisation responsables et d’ajouter au moment opportun les facteurs solubles correspondants pour imiter les étapes critiques du développement du pancréas embryonnaire. Le programme pancréatique commence par l’engagement dans l’endoderme définitif, qui est marqué par les facteurs de transcription forkhead box A2 (FOXA2) et la région déterminant le sexe Y-box 17 (SOX17)7. La différenciation successive de l’endoderme définitif implique la formation d’un tube intestinal primitif, formant un intestin antérieur postérieur qui exprime l’homéobox pancréatique et duodénal 1 (PDX1)7,8,9, et l’expansion épithéliale en progéniteurs pancréatiques qui co-expriment PDX1 et NK6 homéobox 1 (NKX6.1)10,11.
Un engagement supplémentaire dans les cellules des îlots endocriniens s’accompagne de l’expression transitoire de la neurogénine-3 (NGN3)12 et de l’induction stable des facteurs de transcription clés de la différenciation neuronale 1 (NEUROD1) et de l’homéobox 2 NK2 (NKX2.2)13. Les principales cellules exprimant des hormones, telles que les cellules bêta productrices d’insuline, les cellules alpha productrices de glucagon, les cellules delta productrices de somatostatine et les cellules PPY productrices de polypeptides pancréatiques, sont ensuite programmées. Grâce à ces connaissances, ainsi qu’aux découvertes issues d’études approfondies de criblage de médicaments à haut débit, les progrès récents ont permis de générer des îlots hPSC avec des cellules ressemblant à des cellules bêta capables de sécréter de l’insuline 14,15,16,17,18,19.
Des protocoles par étapes ont été rapportés pour générer des cellules bêta sensibles au glucose 6,14,18,19. Basé sur ces études, le présent protocole implique l’utilisation d’un kit de progéniteurs pancréatiques pour générer des cellules progénitrices pancréatiques PDX1+/NKX6.1+ dans une culture planaire, suivie d’une agrégation de plaques de micropuits en grappes de taille uniforme et d’une différenciation supplémentaire vers des îlots hPSC sécrétrices d’insuline avec le protocole R dans une culture statique en suspension 3D. Des analyses de contrôle de la qualité, y compris la cytométrie en flux, l’immunomarquage et l’évaluation fonctionnelle, sont effectuées pour une caractérisation rigoureuse des cellules en voie de différenciation. Cet article fournit une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée et décrit les approches de caractérisation in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un protocole hybride en sept étapes qui permet de générer des îlots hPSC capables de sécréter de l’insuline lors d’une provocation au glucose dans les 40 jours suivant la culture in vitro. Parmi ces multiples étapes, l’induction efficace de l’endoderme définitif est considérée comme un point de départ important pour les résultats finaux de différenciation18,27,28. Selon le protoc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, FRDJ et les Instituts de recherche en santé du Canada pour leur soutien. Jia Zhao et Shenghui Liang sont les récipiendaires de la bourse Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam est récipiendaire de la bourse Mitacs Accélération. Diepiriye G. Iworima est récipiendaire de la bourse d’études supérieures du Canada Alexander-Graham-Bell et du Prix commémoratif de l’École Polytechnique 1989 de la FCFDU. Nous remercions sincèrement le Dr Edouard G. Stanley de l’IRMC et de l’Université Monash d’avoir partagé la ligne Mel1 INS GFP/W et l’Alberta Diabetes Institute Islet Core pour l’isolement et la distribution des îlots humains. Nous tenons également à souligner le soutien des installations d’imagerie et de cytométrie en flux de l’Institut des sciences de la vie de l’Université de la Colombie-Britannique. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
Referências
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
