Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern
Summary
Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.
Abstract
Die Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in insulinsezernierende Betazellen liefert Material für die Untersuchung der Betazellfunktion und der Diabetesbehandlung. Es besteht jedoch nach wie vor eine Herausforderung bei der Gewinnung von aus Stammzellen gewonnenen Betazellen, die native menschliche Betazellen adäquat nachahmen. Aufbauend auf früheren Studien wurden hPSC-abgeleitete Inselzellen generiert, um ein Protokoll mit verbesserten Differenzierungsergebnissen und Konsistenz zu erstellen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein Pankreas-Vorläufer-Kit in den Phasen 1-4, gefolgt von einem Protokoll, das aus einer zuvor 2014 veröffentlichten Arbeit (im Folgenden als “R-Protokoll” bezeichnet) während der Phasen 5-7 modifiziert wurde. Detaillierte Verfahren für die Verwendung des Pankreas-Vorläufer-Kits und der Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferclustern, das R-Protokoll für die endokrine Differenzierung in einem statischen 96-Well-Suspensionsformat sowie die In-vitro-Charakterisierung und funktionelle Bewertung von hPSC-abgeleiteten Inseln sind enthalten. Das vollständige Protokoll dauert 1 Woche für die anfängliche hPSC-Expansion, gefolgt von ~5 Wochen, um insulinproduzierende hPSC-Inseln zu erhalten. Personal mit grundlegenden Stammzellkulturtechniken und Ausbildung in biologischen Assays kann dieses Protokoll reproduzieren.
Introduction
Betazellen der Bauchspeicheldrüse schütten Insulin aus, das auf einen Anstieg des Blutzuckerspiegels reagiert. Patienten, die aufgrund der autoimmunen Zerstörung von Betazellen bei Typ-1-Diabetes (T1D)1 oder aufgrund einer Betazelldysfunktion bei Typ-2-Diabetes (T2D)2 keine ausreichende Insulinproduktion aufweisen, werden in der Regel mit der Gabe von exogenem Insulin behandelt. Trotz dieser lebensrettenden Therapie kann sie nicht genau mit der exquisiten Kontrolle des Blutzuckers mithalten, wie sie durch die dynamische Insulinsekretion aus echten Betazellen erreicht wird. Daher leiden die Patienten häufig unter den Folgen lebensbedrohlicher hypoglykämischer Episoden und anderer Komplikationen, die aus chronischen hyperglykämischen Exkursionen resultieren. Die Transplantation menschlicher Leicheninseln stellt bei T1D-Patienten erfolgreich eine strenge glykämische Kontrolle wieder her, ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Inselspendern und Schwierigkeiten bei der Reinigung gesunder Inseln für die Transplantation eingeschränkt 3,4. Diese Herausforderung kann prinzipiell durch den Einsatz von hPS-Zellen als alternatives Ausgangsmaterial gelöst werden.
Derzeitige Strategien zur Generierung von Insulin-sezernierenden Inseln aus hPS-Zellen in vitro zielen häufig darauf ab, den Prozess der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse in vivo nachzuahmen 5,6. Dies erfordert die Kenntnis der verantwortlichen Signalwege und die zeitgesteuerte Zugabe entsprechender löslicher Faktoren, um kritische Stadien der sich entwickelnden embryonalen Bauchspeicheldrüse nachzuahmen. Das Pankreasprogramm beginnt mit der Bindung in das definitive Endoderm, das durch die Transkriptionsfaktoren Gabelkopfbox A2 (FOXA2) und geschlechtsbestimmende Region Y-Box 17 (SOX17)7 gekennzeichnet ist. Die sukzessive Differenzierung des definitiven Endoderms beinhaltet die Bildung eines primitiven Darmschlauchs, der in einen hinteren Vorderdarm übergeht, der die Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1 (PDX1)7,8,9 exprimiert, und die epitheliale Expansion in pankreatische Vorläuferzellen, die PDX1 und NK6-Homöobox 1 (NKX6.1)10,11 co-exprimieren.
Das weitere Engagement für endokrine Inselzellen geht einher mit der vorübergehenden Expression des pro-endokrinen Masterregulators Neurogenin-3 (NGN3)12 und der stabilen Induktion der wichtigsten Transkriptionsfaktoren neuronale Differenzierung 1 (NEUROD1) und NK2-Homöobox 2 (NKX2.2)13. Anschließend werden die wichtigsten hormonexprimierenden Zellen, wie insulinproduzierende Betazellen, Glucagon-produzierende Alphazellen, Somatostatin-produzierende Delta-Zellen und Pankreas-Polypeptid-produzierende PY-Zellen, programmiert. Mit diesem Wissen sowie Entdeckungen aus umfangreichen Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Studien haben jüngste Fortschritte die Erzeugung von hPSC-Inseln mit Zellen ermöglicht, die Betazellen ähneln, die zur Insulinsekretion fähig sind 14,15,16,17,18,19.
Es wurde über schrittweise Protokolle zur Generierung von Glukose-responsiven Betazellen berichtet 6,14,18,19. Aufbauend auf diesen Studien beinhaltet das vorliegende Protokoll die Verwendung eines Pankreas-Vorläuferkits zur Generierung von PDX1+/NKX6.1+ Pankreas-Vorläuferzellen in einer planaren Kultur, gefolgt von der Aggregation von Mikrotiterplatten zu Clustern einheitlicher Größe und der weiteren Differenzierung in Richtung Insulin-sezernierende hPSC-Inseln mit dem R-Protokoll in einer statischen 3D-Suspensionskultur. Qualitätskontrollanalysen, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunfärbung und funktioneller Bewertung, werden zur rigorosen Charakterisierung der differenzierenden Zellen durchgeführt. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte der gerichteten Differenzierung und skizziert die in vitro Charakterisierungsansätze.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wird ein siebenstufiges Hybridprotokoll beschrieben, das die Erzeugung von hPSC-Inseln ermöglicht, die in der Lage sind, Insulin bei Glukoseprovokation innerhalb von 40 Tagen nach der Kultur in vitro zu sezernieren. Es wird angenommen, dass die effiziente Induktion des definitiven Endoderms unter diesen mehreren Schritten einen wichtigen Ausgangspunkt für die endgültigen Differenzierungsergebnisse darstellt18,27,28<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns für die Unterstützung von STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF und den Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao und Shenghui Liang wurden mit dem Michael Smith Health Research BC Trainee Award ausgezeichnet. Mitchell J.S. Braam ist Stipendiat des Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima ist Stipendiatin des Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship und des CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Wir danken Dr. Edouard G. Stanley vom MCRI und der Monash University für die gemeinsame Nutzung der Mel1 INS GFP/W-Linie und dem Inselkern des Alberta Diabetes Institute für die Isolierung und Verteilung menschlicher Inseln. Wir bedanken uns auch für die Unterstützung durch die Einrichtungen des Life Sciences Institute für Bildgebung und Durchflusszytometrie an der University of British Columbia. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
Referências
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