इंसुलिन उत्पादक आइलेट समूहों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का भेदभाव
Summary
आइलेट कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव पारंपरिक मधुमेह उपचार और रोग मॉडलिंग के लिए एक वैकल्पिक समाधान प्रदान करता है। हम एक विस्तृत स्टेम सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन है कि इंसुलिन स्रावित उत्पादन में सहायता करने के लिए एक पहले से मान्य विधि के साथ एक वाणिज्यिक भेदभाव किट को जोड़ती है, एक डिश में स्टेम सेल व्युत्पन्न आइलेट.
Abstract
इंसुलिन-स्रावित बीटा कोशिकाओं में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) का भेदभाव बीटा सेल फ़ंक्शन और मधुमेह उपचार की जांच के लिए सामग्री प्रदान करता है। हालांकि, चुनौतियां स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं को प्राप्त करने में बनी हुई हैं जो पर्याप्त रूप से देशी मानव बीटा कोशिकाओं की नकल करती हैं। पिछले अध्ययनों पर बिल्डिंग, एचपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट कोशिकाओं को बेहतर भेदभाव परिणामों और स्थिरता के साथ एक प्रोटोकॉल बनाने के लिए उत्पन्न किया गया है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल चरण 1-4 के दौरान एक अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग करता है, एक प्रोटोकॉल पहले से प्रकाशित एक कागज से संशोधित द्वारा पीछा 2014 (इसके बाद “आर प्रोटोकॉल” कहा जाता है) चरण 5-7 के दौरान. अग्नाशयी पूर्वज किट और 400 माइक्रोन व्यास माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं अग्नाशयी पूर्वज समूहों उत्पन्न करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से स्थिर निलंबन प्रारूप में अंतःस्रावी भेदभाव के लिए आर प्रोटोकॉल, और इन विट्रो लक्षण वर्णन और एचपीएससी व्युत्पन्न आइलेट्स के कार्यात्मक मूल्यांकन में शामिल हैं. पूरा प्रोटोकॉल लेता है 1 प्रारंभिक एचपीएससी विस्तार के लिए सप्ताह के बाद ~ 5 सप्ताह इंसुलिन उत्पादक एचपीएससी आइलेट्स प्राप्त करने के लिए. बुनियादी स्टेम सेल संस्कृति तकनीक और जैविक assays में प्रशिक्षण के साथ कार्मिक इस प्रोटोकॉल पुन: पेश कर सकते हैं.
Introduction
अग्नाशयी बीटा कोशिकाएं रक्त शर्करा के स्तर में वृद्धि का जवाब देने वाले इंसुलिन का स्राव करती हैं। प्रकार में बीटा कोशिकाओं के autoimmune विनाश के कारण पर्याप्त इंसुलिन उत्पादन की कमी रोगियों 1 मधुमेह (T1D)1, या प्रकार में बीटा सेल की शिथिलता के कारण 2 मधुमेह (T2D)2, आमतौर पर exogenous इंसुलिन के प्रशासन के साथ इलाज कर रहे हैं. इस जीवन रक्षक चिकित्सा के बावजूद, यह रक्त शर्करा के उत्तम नियंत्रण से सटीक रूप से मेल नहीं खा सकता है जैसा कि बोना फाइड बीटा कोशिकाओं से गतिशील इंसुलिन स्राव द्वारा प्राप्त किया जाता है। जैसे, रोगियों को अक्सर जीवन-धमकाने वाले हाइपोग्लाइसेमिक एपिसोड और क्रोनिक हाइपरग्लाइसेमिक भ्रमण के परिणामस्वरूप अन्य जटिलताओं के परिणाम भुगतते हैं। मानव कैडेवरिक आइलेट्स का प्रत्यारोपण सफलतापूर्वक T1D रोगियों में तंग ग्लाइसेमिक नियंत्रण को पुनर्स्थापित करता है, लेकिन आइलेट दाताओं की उपलब्धता और प्रत्यारोपण 3,4 के लिए स्वस्थ आइलेट्स को शुद्ध करने में कठिनाइयों से सीमित है। यह चुनौती, सिद्धांत रूप में, वैकल्पिक प्रारंभिक सामग्री के रूप में एचपीएससी का उपयोग करके हल की जा सकती है।
इन विट्रो में एचपीएससी से इंसुलिन-स्रावित आइलेट्स पैदा करने के लिए वर्तमान रणनीतियों का उद्देश्य अक्सर विवो 5,6 में भ्रूण अग्न्याशय के विकास की प्रक्रिया की नकल करना होता है। इसके लिए जिम्मेदार सिग्नलिंग मार्गों के ज्ञान और विकासशील भ्रूण अग्न्याशय के महत्वपूर्ण चरणों की नकल करने के लिए संबंधित घुलनशील कारकों के समयबद्ध जोड़ की आवश्यकता होती है। अग्नाशयी कार्यक्रम निश्चित एंडोडर्म में प्रतिबद्धता के साथ शुरू होता है, जिसे प्रतिलेखन कारक फोर्कहेड बॉक्स A2 (FOXA2) और लिंग-निर्धारण क्षेत्र Y-box 17 (SOX17)7 द्वारा चिह्नित किया जाता है। निश्चित एंडोडर्म के क्रमिक भेदभाव में एक आदिम आंत ट्यूब का गठन शामिल होता है, जो एक पीछे के अग्रभाग में पैटर्न करता है जो अग्नाशयी और ग्रहणी संबंधी होमोबॉक्स 1 (पीडीएक्स 1) 7,8,9 को व्यक्त करता है, और अग्नाशयी पूर्वजों में उपकला विस्तार जो पीडीएक्स 1 और एनके 6 होमोबॉक्स 1 (एनकेएक्स 6.1) 10,11 को सह-व्यक्त करता है।
अंतःस्रावी आइलेट कोशिकाओं के लिए आगे की प्रतिबद्धता प्रो-अंतःस्रावी मास्टर नियामक न्यूरोजेनिन -3 (एनजीएन 3) 12 की क्षणिक अभिव्यक्ति और प्रमुख प्रतिलेखन कारकों न्यूरोनल भेदभाव 1 (NEUROD1) और एनके 2 होमोबॉक्स 2 (एनकेएक्स 2.2) 13 के स्थिर प्रेरण के साथ है। प्रमुख हार्मोन-व्यक्त करने वाली कोशिकाएं, जैसे इंसुलिन-उत्पादक बीटा कोशिकाएं, ग्लूकागन-उत्पादक अल्फा कोशिकाएं, सोमाटोस्टैटिन-उत्पादक डेल्टा कोशिकाएं, और अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड-उत्पादक पीपीवाई कोशिकाएं, बाद में प्रोग्राम की जाती हैं। इस ज्ञान के साथ-साथ व्यापक, उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग अध्ययनों से खोजों के साथ, हाल की प्रगति ने एचपीएससी-आइलेट्स की पीढ़ी को इंसुलिन स्राव 14,15,16,17,18,19 में सक्षम बीटा कोशिकाओं के समान कोशिकाओं के साथ सक्षम किया है।
ग्लूकोज-उत्तरदायी बीटा कोशिकाओंको 6,14,18,19 उत्पन्न करने के लिए चरण-वार प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है। इन अध्ययनों पर निर्मित, वर्तमान प्रोटोकॉल में एक प्लानर संस्कृति में PDX1+/NKX6.1+ अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग शामिल है, इसके बाद एक समान आकार के समूहों में माइक्रोवेल प्लेट एकत्रीकरण और एक स्थिर 3D निलंबन संस्कृति में आर-प्रोटोकॉल के साथ इंसुलिन-स्रावित एचपीएससी-आइलेट्स की ओर और भेदभाव होता है। प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोस्टेनिंग और कार्यात्मक मूल्यांकन सहित गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण, विभेदक कोशिकाओं के कठोर लक्षण वर्णन के लिए किया जाता है। यह पत्र निर्देशित भेदभाव के प्रत्येक चरण का विस्तृत विवरण प्रदान करता है और इन विट्रो लक्षण वर्णन दृष्टिकोणों की रूपरेखा तैयार करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पत्र एक सात चरण हाइब्रिड प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एचपीएससी आइलेट्स की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जो इन विट्रो में संस्कृति के 40 दिनों के भीतर ग्लूकोज चुनौती पर इंसुलिन को स्रावित करने में स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञतापूर्वक STEMCELL टेक्नोलॉजीज, माइकल स्मिथ हेल्थ रिसर्च बीसी, स्टेम सेल नेटवर्क, JDRF, और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान से समर्थन स्वीकार करते हैं। जिया झाओ और शेंघुई लियांग माइकल स्मिथ हेल्थ रिसर्च बीसी ट्रेनी अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। मिशेल जेएस ब्राम मितक्स एक्सीलरेट फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं। Diepiriye G. Iworima अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलरशिप और CFUW 1989 इकोले पॉलिटेक्निक स्मारक पुरस्कार के प्राप्तकर्ता हैं। हम ईमानदारी से एमसीआरआई और मोनाश विश्वविद्यालय से डॉ. एडौर्ड जी स्टेनली को Mel1 INS GFP/W लाइन और अल्बर्टा डायबिटीज इंस्टीट्यूट आइलेट कोर को मानव आइलेट्स को अलग करने और वितरित करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में लाइफ साइंसेज इंस्टीट्यूट इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री सुविधाओं से समर्थन को भी स्वीकार करते हैं। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
Referências
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